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中国生物制品学 2009年第10期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的真核表达945-948

摘要：目的在小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中表达抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体。方法真核表达质粒PAG4622＋CD4VL和PAH4604＋CD4VH经酶切和序列测定后,采用电穿孔转染技术将二者共转染SP2/0细胞,经组胺醇和霉酚酸联合筛选阳性克隆,通过ELISA、流式细胞术、RT-PCR和DNA测序的方法进行初步鉴定。结果真核表达质粒经酶切和测序鉴定证明构建正确。获得2株分泌抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的阳性SP2/0细胞克隆0925CASP2/0和1107CASP2/0,嵌合抗体表达量为0.5-2ng/ml。结论已成功地在SP2/0细胞中表达了抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体,为该抗体在其他真核细胞中的高效表达及临床应用奠定了基础。

结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌分泌蛋白指纹图谱的比较953-956

摘要：目的比较结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分泌蛋白的指纹图谱,分析分泌蛋白表达的差异,为分枝杆菌的快速鉴别奠定基础。方法选取结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌标准菌株,培养后灭活,提取分泌蛋白,用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）检测菌株分泌蛋白的表达,Biomaker Wizard Software分析软件筛选差异蛋白。重复测定20次分枝杆菌分泌蛋白,评价SELDI-TOF-MS检测分枝杆菌分泌蛋白相对分子质量的重复性。结果AU芯片能捕获近30个分枝杆菌分泌蛋白峰,4个蛋白峰为分枝杆菌共有。与非结核分枝杆菌分泌蛋白指纹图谱比较,有1个蛋白峰为结核分枝杆菌所特有。SELDI-TOF-MS重复检测20次分枝杆菌分泌蛋白显示,同一蛋白峰的相对分子质量变异系数≤0.05%。结论结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌差异蛋白的发现,可能有助于分枝杆菌的鉴别。

双启动子对增强型绿色荧光蛋白表达的影响957-960

摘要：目的研究双启动子对增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达的影响及双启动子的启动效率。方法分别将H1、U2、U3和U6启动子克隆至pEGFP-N1载体中的MCS位点处,构建CMV与以上各个启动子的双启动子表达载体。将重组载体转染293T细胞,荧光显微镜观察,流式细胞术检测转染效率及EGFP基因的表达效率（以荧光指数表示）。结果双启动子重组表达载体经PCR和酶切证明构建正确。流式细胞术检测表明,pEGFP-N1载体与分别插入H1、U2、U3和U6启动子的双启动子重组表达载体的转染效率分别为26.57%±1.54%、28.57%±0.99%、16.14%±1.69%、22.63%±1.77%和17.89%±1.84%;EGFP基因的表达效率分别为142.79±31.26、103.59±25.90、19.67±0.52、58.16±14.58和15.40±1.92。结论CMV与H1启动子联合驱动EGFP的表达效果与CMV单独驱动相近,而CMV分别与U2、U3和U6启动子联合驱动EGFP的表达效果显著低于CMV单独驱动。

稳定表达Ag85A蛋白细胞系的建立964-967

摘要：目的建立稳定表达Ag85A蛋白的K562真核细胞系,为进一步开展以阳离子脂质体为转运载体的口服疫苗的免疫原性研究奠定基础。方法将已构建的重组质粒pCDNA3.1＋/Ag85A包裹阳离子脂质体LipofectamineTM 2000后,转染真核细胞K562,SDS-PAGE和Western blot分析重组Ag85A蛋白的表达。用G418筛选稳定表达Ag85A蛋白的细胞株,流式细胞术和间接免疫荧光技术检测Ag85A蛋白的表达及定位。结果重组质粒pCDNA3.1＋/Ag85A转染K562细胞时,与脂质体的最适比例为2μg：2μl;转染细胞表达的Ag85A蛋白相对分子质量约为32000,且具有良好的反应原性。稳定转染3个月后,重组质粒转染的细胞有42.37%的细胞显示FITC标记,且细胞胞浆中及细胞膜上均有Ag85A蛋白的表达。结论已获得稳定表达Ag85A蛋白的K562细胞系,可用于Ag85A蛋白的大量制备及抗体方面的研究。

新城疫病毒TL1株F、HN蛋白基因共表达对细胞融合的影响968-970

摘要：目的分析新城疫病毒TL1株F、HN蛋白基因共表达对细胞融合的影响。方法在6孔细胞培养板上将4种重组表达质粒以pCI-M＋pCI-NP＋pCI-F和pCI-M＋pCI-NP＋pCI-F＋pCI-HN两种组合分别共转染BHK-21细胞,转染后48h,光镜观察细胞融合现象。在25cm2细胞培养瓶中,将4种重组表达质粒以上述两种组合分别共转染BHK-21细胞,转染后48h,收集细胞上清,离心后,电镜观察有无病毒样颗粒。结果以pCI-M＋pCI-NP＋pCI-F＋pCI-HN组合共转染BHK-21细胞,可以观察到明显的细胞融合现象,而以pCI-M＋pCI-NP＋pCI-F组合共转染的BHK-21细胞则未出现细胞融合现象。两种组合共转染均形成了新城疫病毒样颗粒,包含HN蛋白基因的4种重组质粒组合共转染形成的病毒样粒子更接近于真实的新城疫病毒粒子。结论HN蛋白基因具有促进细胞融合的功能,新城疫病毒样颗粒的成功表达为新城疫病毒致病机理和新型疫苗的研究奠定了基础。

蜂毒明肽的原核表达及纯化971-974

摘要：目的原核表达并纯化蜂毒明肽。方法人工合成蜂毒明肽基因,与肠激酶识别序列基因串联,插入原核表达载体pGEX-2T中,构建蜂毒明肽与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达载体pGEX-APAM。将重组质粒转化E. coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并进行纯化和肠激酶切割。结果经Western blot鉴定,表达产物具有良好的反应原性。在优化的表达条件下,融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的25.8%,且大部分以可溶性形式存在。纯化的融合蛋白纯度大于95%,每毫克融合蛋白经肠激酶切割后,可得蜂毒明肽58.5μg,回收率为81.9%。结论已成功地原核表达并纯化了蜂毒明肽。

Survivin-siRNA真核表达载体的构建及其对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响975-978

摘要：目的构建Survivin-siRNA真核表达载体,并探讨其对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法化学合成4条能转录出siRNA的模板DNA,各75个碱基,退火形成2条双链DNA,双酶切后插入pSUPER.basic载体。将阳性重组质粒转染SGC-7901细胞,进行细胞计数,并用MTT法检测细胞的增殖活性;半定量RT-PCR检测细胞Survivin基因mRNA的转录水平;流式细胞术检测细胞周期的变化。结果PCR和酶切鉴定表明Survivin-siRNA真核表达载体构建正确,其能下调SGC-7901细胞Survivin基因mRNA的转录水平,抑制SGC-7901细胞生长和增殖,并促进细胞凋亡,使G0/G1和亚G1期细胞增多,S期细胞减少。结论已成功构建了Survivin-siRNA真核表达载体,其能下调SGC-7901细胞中Survivin基因mRNA的转录水平,使细胞增殖减弱,凋亡增加,为RNA干扰技术应用于胃癌的基因治疗提供了一定的实验依据。

HRE/Egr-1调控的shTRAIL基因对A549细胞的辐射增敏效应979-982

摘要：目的观察HRE/Egr-1调控的shTRAIL基因对肺腺癌A549细胞的辐射增敏效应。方法将前期构建的含有HRE/Egr-1双敏感启动子介导的shTRAIL基因的质粒pcDNA3.1-HRE/Egr1-shTRAIL经脂质体介导,转染肺腺癌A549细胞,将转染细胞分为3组：乏氧组、照射组和乏氧＋照射组,分别进行相应处理,并设正常细胞作为对照。RT-PCR检测各组细胞shTRAIL基因mRNA的转录水平;双抗体夹心ABC-ELISA检测各组细胞上清中shTRAIL的含量;平板克隆实验检测各组细胞的放射敏感性。结果乏氧组、照射组和乏氧＋照射组A549细胞shTRAIL基因mRNA的转录水平及细胞上清中shTRAIL蛋白的含量均较正常对照组明显增加,其中,乏氧＋照射组最高。常氧条件下,转染质粒pcDNA3.1-HRE/Egr1-shTRAIL的A549细胞和正常对照组细胞的D0值分别为1.89和3.26;而在乏氧条件下,两组的D0值分别为1.13和5.81,表明乏氧条件下质粒转染组A549细胞的放射敏感性最高。结论HRE/Egr-1调控的shTRAIL基因在乏氧和辐射条件下,能够诱导A549细胞中shTRAIL基因mRNA转录和蛋白表达水平增加,并增加细胞的放射敏感性。

氯沙坦对肾衰大鼠RAS基因表达的影响983-985

摘要：目的观察氯沙坦对肾衰大鼠肾组织肾素-血管紧张素系统（RAS）血管紧张素1型受体（AT1）、血管紧张素2型受体（AT2）、血管紧张素转化酶（ACE）及血管紧张素原（AGT）基因表达的影响,探讨RAS在慢性肾衰发生发展过程中的作用。方法复制阿霉素（ADR）慢性肾衰大鼠动物模型,随机分为模型（ADR）组和血管紧张素受体拮抗剂（ARB）氯沙坦（ADR＋ARB）组,氯沙坦组给予氯沙坦灌胃,另设正常大鼠对照组。取各组大鼠肾组织,经HE染色进行形态学观察,半定量RT-PCR法检测AT1、AT2、ACE及AGT基因mRNA的转录水平。结果与对照组相比,ADR组大鼠肾小球和肾小管出现明显的病变,而ADR＋ARB组病变明显减轻。与对照组相比,ADR组AT1﹑AGT和ACE基因表达上调,AT2基因表达下调;与ADR组相比,ADR＋ARB组AT1和AGT基因表达下调;ADR＋ARB组的AT2基因表达水平接近对照组,ACE基因表达下调,但仍高于对照组水平。结论慢性肾损伤的发生发展可能与AT1、AGT及ACE基因表达水平增高有关。

中国生物制品学杂志预防制品

Vero细胞制备流感病毒疫苗986-989

摘要：目的利用转瓶培养Vero细胞制备流感病毒疫苗。方法将流感病毒接种于Vero细胞上培养,优化培养条件,收获的病毒液经灭活、超滤浓缩和层析纯化,检测病毒的血凝素（HA）滴度及血凝素含量。按此工艺制备流感疫苗,根据血凝素含量稀释为不同浓度,免疫小鼠,观察不良反应,并通过血凝抑制（HI）试验检测抗体水平。结果Vero细胞培养流感病毒的最佳条件为：维持液中胰酶浓度12.5-15μg/ml,pH值7.4-7.6,Vero细胞经多次洗换后再接种病毒,病毒在细胞上培养72-96h收毒。所有免疫小鼠均未出现不良反应,小鼠抗体阳转率均为100%,HI抗体滴度均不低于同剂量的阳性对照组。结论Vero细胞可用于流感病毒的培养和制备疫苗。

中国生物制品学杂志治疗制品

Exendin-4结构的稳定性及其微球制备993-997

摘要：目的分析影响Exendin-4二级结构稳定性的各种因素,并制备Exendin-4微球。方法利用远紫外圆二色光谱（Circular dichroism,CD）技术,分析pH值、温度、高速搅拌、油水界面对Exendin-4二级结构的影响及冰浴和蛋白质保护剂对其二级结构的保护作用。在此基础上,选用乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）为成球材料,采用复乳法（W/O/W）制备Exendin-4微球,并对其理化性质进行评价。结果优化了实现Exendin-4二级结构稳定性的药剂学方法。制备的Exendin-4微球流动性良好,球形圆整,平均粒径为（25.3±3.2）μm,结构保持完好,微球的载药量约为1.0%,包封率为72.3%±2.4%,微球的释药曲线符合Higuchi释放模型,未发生明显的突释,具有良好的缓释效果。结论采取适当的药剂学方法,可以保证Exendin-4结构的稳定性并制备出理化性质合格的微球。

从大容量噬菌体抗体库获取人源性抗角蛋白抗体ScFv及Diabody的构建998-1001

摘要：目的从大容量噬菌体抗体库筛选人源性抗角蛋白抗体,并构建双体抗体（Diabody）。方法以固相化的角蛋白对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经3-4轮筛选后,挑取克隆,ELISA法鉴定其特异性,并对部分抗角蛋白阳性抗体克隆基因进行DNA序列分析。选取活性好的克隆基因进行改造,构建Diabody表达载体。结果在抗体库的筛选过程中可见明显的富集现象,获得了29株可与角蛋白特异性结合的人源单链抗体,选取4个克隆基因进行序列分析,结果表明,4个克隆的轻链基因均属于λ轻链第1亚群,1号和8号克隆的重链基因属于人IgG第2亚群,6号和29号克隆分别属于第1和第3亚群。从表达抗角蛋白抗体的集落中挑选一个进行基因改造,构建的Diabody表达载体所表达的Diabody活性较高。结论利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗角蛋白抗体,并改造成应用前景较好的Diabody,为开发银屑病治疗性抗体奠定了基础。

重组碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂的制备1002-1004

摘要：目的制备重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）凝胶剂。方法以卡波姆940、甘油、1,2丙二醇为基质,加入复方保护剂（肝素钠、人血白蛋白、甘露醇和HP-β-CD）,制成bFGF凝胶剂,观察25和4℃保存的稳定性,并进行家兔局部刺激试验、急性毒性试验、促烧伤创面愈合试验。结果bFGF凝胶剂在25℃保存18个月、4℃保存24个月,效价维持在原效价的80%以上;局部用药未见皮肤刺激反应和急性毒性反应;促家兔烧伤创面愈合的效果明显优于水溶液剂。结论制备的bFGF凝胶剂安全有效,具有缓释作用,稳定性良好,具有广阔的临床应用前景。

中国生物制品学杂志诊断制品

抗轮状病毒LLR株G10血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定1005-1009

摘要：目的制备抗轮状病毒（RV）LLR株G10血清型特异性单克隆抗体,并鉴定其特性。方法以纯化的RVLLR株（血清型为G10）为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术筛选分泌G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。采用层析法纯化单抗,常规免疫学方法鉴定单抗的特性。结果经筛选获得5G5、1H1和7F6共3株可稳定分泌高效价且具有G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。3株细胞分泌的单抗分别为IgG2a/κ、IgG2a/κ和IgG1/κ型;腹水效价均可达1.024×106;分别识别两个抗原位点;相对亲和力依次为1H1﹥7F6﹥5G5;5G5和1H1（细胞上清）均与G1-G4和G6血清型RV抗原无交叉反应;3株杂交瘤细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约为34000的VP7蛋白,且均有不同程度的中和活性。结论已成功制备了抗RVLLR株G10血清型特异性单抗,该单抗可用于G10血清型RV的分型检测或LLR毒株的鉴别。

中国生物制品学杂志临床观察

第二届全国药物性损害与安全用药学术会议——抗感染药物不良反应与临床安全应用专题研讨会征文通知1009-1009

摘要：抗感染药物是临床使用最广泛、最重要的药物之一,但严重不良反应、不合理用药及微生物耐药性等问题引起的危害受到医药卫生工作者的密切关注。

白细胞介素-1B和肿瘤坏死因子-α基因多态性与胃溃疡、胃癌易感性的相关性1010-1014

摘要：目的探讨人群中白细胞介素-1B（IL-1B）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因多态性与胃溃疡、胃癌易感性的相关性。方法选取幽门螺杆菌阳性的39例胃溃疡患者、35例胃癌患者和70名健康对照者,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析法检测该人群中IL-1B-511、TNF-A-308和TNF-A-857基因多态性。结果疾病组与对照组中IL-1B-511各基因型频率的分布差异无统计学意义。与对照组比较,胃溃疡组TNF-A-308各基因型的频率分布、TNF-A-857各基因型的频率分布以及胃癌组TNF-A-308各基因型的频率分布差异均有统计学意义。经Logistic回归分析,与携带TNF-A-308G/G者比较,携带TNF-A-308A/A者发生胃溃疡的危险性为OR=21.62（95%CI：2.07～226.13）;与携带TNF-A-857C/C者比较,携带TNF-A-857T/T者发生胃溃疡的危险性为OR=5.37（95%CI：1.28～22.50）;与携带TNF-A-308G/G者比较,携带TNF-A-308A/A者发生胃癌的危险性为OR=16.41（95%CI：1.62～116.55）。结论TNF-α基因多态性与胃溃疡、胃癌的易感性相关。

5例狂犬咬伤者暴露后的处置效果观察1014-1014

摘要：2008年11月16-17日,浙江省淳安县-9月龄狼狗对潘店、鸠岭山两个自然村共7人进行了主动攻击,其中5人有较为明显的伤口暴露：Ⅲ度暴露2人,Ⅱ度暴露3人。该犬被杀死后,由淳安县疾病控制中心送武汉生物制品研究所检测,通过直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法,初步确认狂犬病病毒阳性,同时取犬脑组织,提取病毒RNA,进行RT-PCR检测,并经1日龄昆明乳鼠分离病毒,均确认为狂犬病病毒阳性。

中国生物制品学杂志实验技术

上海市虹口区15岁以上人群麻疹抗体水平监测与分析1015-1018

摘要：目的了解上海市虹口区15岁以上人群麻疹抗体水平和麻疹发病情况,为制定成人麻疹免疫策略提供依据。方法定量ELISA法检测本区及外来15岁以上人群的麻疹抗体水平,与微量细胞中和法检测结果进行比较,并对1998-2007年本区和外来16岁以上人群麻疹发病资料进行分析。结果本区和外来15岁以上人群麻疹抗体平均阳性率分别为96.83%和98.21%,麻疹抗体GMT平均水平分别为1217.86和1553.73IU/ml,本区各年龄组抗体GMT水平15-19岁组最低,40岁以上组最高;外来各年龄组间抗体GMT水平差异无统计学意义,15-19岁组和30-39岁组麻疹抗体水平显著高于本区人群;ELISA法与微量细胞中和法检测结果呈正相关,回归方程有统计学意义,15岁以上人群中仅有83.5%达到麻疹抗体保护性水平;近10年来,本区与外来16岁以上人群中麻疹发病比例有逐年增高的趋势,本区发病比例显著高于外来人群。结论为消除麻疹,有必要制定成人麻疹免疫策略,其中本区成人麻疹防制策略较外来成人更为紧迫。