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中国生物制品学 2009年第01期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

HCV 2a J6JFH细胞感染模型的建立及初步应用1-5

摘要：目的建立能够自主复制的丙型肝炎病毒（HCV）体外细胞感染模型。方法制备HCV 2a FL-J6JFH和阴性对照FL-J6JFH（GND）RNA转录体，分别转染Huh-7．5细胞，荧光定量PCR（FQ—PCR）检测细胞内HCV RNA水平，免疫荧光法（IFA）检测细胞内HCV蛋白的表达。以转染细胞上清液感染Naive Huh-7．5细胞，检测HCV感染性病毒颗粒（HCVcc）的产生。将细胞用不同浓度的IFNα处理，观察所建立的细胞感染模型对IFNα的敏感性。结果转染后第5天，FL-J6JFH转染细胞内HCVRNA为1．2×10^6GE／μg RNA，第9天下降至最低水平，随后上升，于第13天达到最高值6．5×10^6GE／μg RNA，此后直至第59天，均保持在10^6GE／μg RNA左右，而FL—J6JFH（GND）转染细胞内HCV RNA则很快消失。FL—J6JFH转染的细胞内始终可以检测到HCV蛋白表达，而对照细胞内均未检测到。从第5天起，各时间点的FL-J6JFH转染细胞均能产生HCVcc。IFNμ能够有效抑制HCVcc感染Huh-7．5细胞，并呈剂量依赖性。结论已成功建立了能持续产生HCVcc的HCV 2a型体外细胞感染模型，IFNμ能抑制FL＋J6JFH HCVcc感染细胞中HCV RNA的复制，为研究HCV的结构与功能提供了实验平台。

人NIRF基因真核表达质粒的构建及其蛋白产物的生物信息学分析6-9

摘要：目的克隆人NIRF基因，构建其真核表达质粒，并运用生物信息学方法对NIRF蛋白进行分析。方法应用RT—PCR技术，从HeLa细胞中扩增NIRF基因，插入到真核表达载体pcDNA3．1-Flag中，双酶切鉴定并测序。在NCBI蛋白质结构数据库中寻找与NIRF具有较高同源性的1WY8和1Z6U，并利用InsightⅡ结构生物信息学分析软件分析NIRF蛋白的结构和功能。结果扩增出约2400bp的人NIRF全长cDNA；重组真核表达质粒pcDNA3．1-Flag—NIRF酶切后，可见约2400bp的目的片段；测序结果表明NIRF全长cDNA与GenBank中NIRF序列完全一致。1WY8片段有3个赖氨酸残基，主要位于蛋白空间构象的表面；1Z6U片段含有Ring finger结构域，具有ligase活性.结论已成功克隆了人NIRF基因全长cDNA，构建了其真核表达质粒，并利用生物信息学方法，初步分析了NIRF蛋白泛素化作用的机理。

3株新城疫病毒体外对人喉癌Hep-2细胞杀伤效应的比较10-13

摘要：目的比较新城疫病毒（NDV）强毒株D817、弱毒株7793和La Sota疫苗株对人喉癌Hep-2细胞的杀伤效应。方法3株病毒经扩增、噬斑纯化后，分别感染Hep-2细胞和喉正常组织细胞，一定时间后，显微镜下观察细胞形态变化，MTT比色法检测病毒对细胞的杀伤效应。结果3株病毒均能在Hep-2细胞中增殖并杀伤细胞，杀伤效应以D817株最高，La Sota株其次，7793株最低，且差异均无统计学意义。杀伤效应与病毒剂量和作用时间呈正相关，显微镜下可见明显的细胞病变。而对喉正常组织细胞的杀伤效应不明显。结论NDV D817株和7793株对喉癌细胞的杀伤效应与La Sota疫苗株相似，而对喉正常组织细胞的杀伤效应不明显，有望成为喉癌生物学治疗新的候选病毒株。

激活素A对L929细胞活性的调节作用14-17

摘要：目的探讨激活素A对小鼠纤维母细胞L929活性的调节作用。方法用不同剂量的激活素A刺激L929细胞，应用还原酶法分析细胞分泌一氧化氮（NO）的水平，RT-PCR法检测细胞诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、纤维连接蛋白（FN）和金属蛋白酶组织抑制物（TIMP）mRNA的表达，应用中性红检测细胞的吞饮活性，MTT法检测细胞的增殖活性。结果L929细胞经激活素A刺激后，与对照组细胞比较，分泌NO的水平明显升高，iNOS mRNA及FN mRNA的表达水平也升高，而TIMP mRNA的表达水平无明显改变。激活素A可以促进L929细胞的吞饮活性，但对L929细胞的增殖活性无影响。结论激活素A具有促进L929细胞分泌炎性介质和形成细胞外基质的作用，这可能是其促进炎症发展、诱导组织纤维化的原因。

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中国生物制品学杂志基础研究

幽门螺杆菌hp1188基因的克隆及高效表达18-21

摘要：目的克隆并表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H．pylori）hp1188基因，为研究幽门螺杆菌的黏附机制奠定基础。方法用PCR法从H．pylori标准株NCTC 11637基因组DNA中扩增hp1188基凶，克隆入原核表达载体pQE-30，构建重组原核表达质粒pQE30-hp1188，转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达。SDS—PAGE分析表达形式和表达量。表达蛋白经Ni2^＋-NTA树脂纯化，Western blot鉴定其反应原性。结果所构建的重组表达质粒pQE30-hp1188序列完整，插入的基因片段全长810bp，与GenBank中的hp1188基因同源性达98％。表达的重组蛋白相对分子质量约为30600，以1．0mmol／L IPTG诱导4h，表达量最高，破菌上清和沉淀中均有表达，可溶性蛋白表达量占全菌总蛋白的47％。重组蛋白纯化后纯度可达90％，并可被H．pylori患者血清识别。结论已成功克隆了H.pylori hp1188基因，并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达。

α-2，6唾液酸转移酶在BHK细胞中的表达22-24

摘要：目的在BHK细胞中表达α-2，6唾液酸转移酶（ST6Gal1），为其相关研究奠定基础。方法提取人肝癌HepG2细胞总RNA，经RT—PCR扩增α-2，6唾液酸转移酶的cDNA，克隆入载体pMD18-T中，测序后将目的基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建真核表达质粒pcDNA3．1-ST6Gal1，并转染BHK细胞，免疫荧光法检测α-2，6唾液酸转移酶的表达。结果克隆的α-2，6唾液酸转移酶基因与GenBank中报道的已知序列完全一致，重组真核表达质粒转染的BHK细胞表面SAα2，6Gal含量增加。结论α-2，6唾液酸转移酶在BHK细胞中获得了有效表达，为流感病毒受体的研究提供了技术支持。

小鼠H-2^q型基因与重组乙型肝炎疫苗免疫应答的相关性25-26

摘要：目的分析小鼠DNA中H-2^q型基因及其与重组酿酒酵母、CHO、汉逊酵母乙肝疫苗免疫应答的相关性。方法重组酿酒酵母、CHO、汉逊酵母乙肝疫苗免疫近交系BALB／c、DBA／1和封闭群NIH小鼠，4周后取血、脾脏和尾，分别采用PCR法和微量细胞毒法检测小鼠H-2^q单倍型基因，ELISA法检测小鼠ED50，并分析H-2^q型基因概率与ED50的相关性。结果DBA／1小鼠H-2^q型基因概率100％，BALB／c小鼠H-2^q型基因概率100％。NIH小鼠H-2^q型基因概率分别为96％、56％，42％和30％。随着H-2^q型基因概率的升高，免疫应答敏感性递增。结论H-2^q型基因对重组乙肝疫苗免疫应答敏感，敏感程度与H-2^q型基因概率密切相关。

生物素-亲和素-DNA纳米颗粒信号放大检测载体的构建27-30

摘要：目的构建用于检测细菌、病毒等病原体DNA的生物素-亲和素纳米颗粒信号放大载体。方法设计并合成两端和一端标记生物素的寡核苷酸探针（2B／1B—DNA），与抗生蛋白链菌素葡聚糖（Poly—STV）通过生物素与亲和素作用，偶联形成大分子纳米网状颗粒，并筛选最佳探针类型及其长度、2B—DNA和Poly—STV的浓度及比例和反应条件。结果2B—DNA和Poly—STV形成纳米颗粒信号放大载体的最佳浓度分别为1μmol／L和5μmol／L，最佳浓度比为1：5，2B-DNA长度为60bp，缓冲液为Buffer B，反应条件为55℃，800r／min，20min。结论已成功构建了生物素-亲和素大分子纳米颗粒，可作为DNA检测信号放大技术的备选载体。

B型肉毒神经毒素重链C-端片段的修饰及表达31-34

摘要：目的修饰、克隆B型肉毒神经毒素重链C-端（BoNT／b HC）片段，并在大肠杆菌中进行表达。方法以B型肉毒梭状杆菌8806株基因组DNA为模板，PCR扩增B型肉毒神经毒素重链的转膜区和结合区，并以高频密码子替换BoNT／b HC基因N-端的5个低频密码子。将目的片段克隆人表达载体pET-42b，转化E.coli BL21（DE3）PlysS，IPTG诱导表达后，进行Westem blot鉴定及可溶性分析。结果重组表达质粒经PCR及酶切鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为80000，表达量占菌体总蛋白的32．6％，主要以包涵体形式存在；重组蛋白可被相应的抗BoNT／b全毒素的多克隆抗体所识别。结论已成功修饰并表达了B型肉毒神经毒素重链C-端片段，为进一步研制重组疫苗及高特异性的诊断试剂奠定了基础。

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征稿34-34

中国生物制品学杂志基础研究

长春地区丙型肝炎病毒的基因分型及其与肝脏疾病的相关性35-37

摘要：目的分析长春地区丙型肝炎病毒（HCV）基因型的分布及其与HCV RNA含量、感染途径、肝病程度的相关性。方法采用荧光定量PCR和型特异性引物PCR对82份抗-HCV阳性病人的血清标本进行HCV RNA检测及HCV的基因分型，并分析基因型与感染途径、HCV RNA含量和肝病程度的相关性。结果78份HCV RNA阳性血清标本中1a型占5．1％、1b型占48．7％、2a型占33．3％、2b型占11．6％、3a型占1．3％，未发现混合型。血源性与非血源性感染患者间HCV基因型构成比差异无统计学意义。基因1b型的HCV RNA含量高于2a型，且差异有统计学意义。HCV感染的不同程度肝病患者的基因型分布差异有统计学意义，基因1b型比率显著高于其他基因型。结论长春地区丙型肝炎病毒基因型流行株为1b和2a型；HCV基因型与感染途径无明显相关性；基因1b型的病毒含量明显高于2a型；HCV基因型与慢性丙型肝炎的严重程度及肝硬化、肝癌的产生有一定的相关性。

金黄葡萄球菌ClfA活性基因的克隆及原核表达38-40

摘要：目的克隆金黄葡萄球菌表而蛋白凝集因子A（ClfA）活性基因，并进行原核表达。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增ClfA（221—550）活性基因，克隆入载体pET28a（＋）中，构建重组表达质粒pET28a—ClfA（221—550），转化感受态大肠杆菌BI．21（DE3），IPTG诱导表达，并对表达产物进行SDS—PAGE和Western blot分析。结果PCR扩增出987bp的目的基因片段，重组表达质粒经双酶切证明构建正确。表达产物经SDS—PAGE分析，在相对分子质量约36000处可见目的条带，目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的36．76％，且具有良好的反应原性。结论已成功克隆了金黄葡萄球菌ClfA活性基因，并在大肠杆菌BI．21（DE3）中表达了目的蛋白.

小鼠sIL-13Rα2基因的克隆及在毕赤酵母中的表达41-44

摘要：目的克隆并在毕赤酵母中表达小鼠sIL-13Rα2基因。方法提取小鼠脾脏细胞总RNA，逆转录为cDNA，应用分段PCR的方法将sIL-13Rα2基因定向克隆至酵母表达质粒pPICZα—A，并转染至毕赤酵母GS115（his4）菌株，进行目的蛋白的诱导表达。表达的蛋白经SDS—PAGE和Western blot，进行分析。结果重组表达质粒pPICZα—A／sIL-13Rα2经酶切鉴定，表明目的基因为正向插入。重组酵母菌的PCR鉴定结果显示，目的基因片段已插入酵母染色体中。目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的30％，每升发酵液约含2mg重组蛋白。重组蛋白可与兔抗小鼠sIL-13Rα2单抗发生特异性反应。结论已成功克隆并在毕赤酵母中表达了小鼠sIL-13Rα2基因，为应用sIL-13Rα2蛋白治疗哮喘及其他过敏性疾病奠定了基础。

丙型肝炎病毒全基因重组质粒的构建及其转染细胞系的建立45-48

摘要：目的构建丙型肝炎病毒（HCV）全基因重组质粒，并建立其转染细胞系。方法双酶切质粒JFH1，回收HCV DNA，分别与真核表达载体pIRESneo和逆转录病毒载体pLNCX连接，构建重组质粒pIRESneo—HCV和pLNCX—HCV。将重组质粒pIRESneo—HCV转染BHK细胞，pLNCX—HCV转染pA317细胞，通过PCR、间接ELISA和免疫荧光试验鉴定转染细胞。结果重组质粒PCR和酶切鉴定证明构建正确。转染细胞上清经PCR检测均可见目的基因条带；ELISA结果表明，转染细胞冻融上清均可与抗HCV小鼠血清发生强的结合反应；转染细胞均可与抗HCV小鼠血清反应，产生荧光，但荧光不多且斑点不亮。结论已成功构建HCV全基因重组质粒，并建立了可表达HCV蛋白的转染细胞系，为转基因动物模型的建立奠定了基础。

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中国生物制品学杂志基础研究

表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株的建立49-51

摘要：目的建立表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株。方法采用PCR方法分别扩增HBsAg及rhIFNα2b基因，以GS linker连接后，克隆人表达质粒pBI121，构建植物细胞表达质粒pBISI，转化农杆菌LBA4404，感染人参愈伤组织细胞。经G418筛选抗性细胞株，提取细胞基因组DNA，进行PCR检测；应用ELISA法检测HBsAg及rhIFNα2b的表达；通过Western blot分析表达蛋白的反应原性。结果重组表达质粒pBISI经酶切鉴定，表明构建正确。筛选得到3株正常生长的人参细胞株，基因组DNA扩增得到约1200bp的融合基因片段；经ELISA检测，其中1株能够表达HBsAg及rhIFNα2b；表达的蛋白与鼠抗HBsAg血清在相对分子质量35000处出现特异条带。结论已获得了表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株。

人核迁移蛋白C与血小板生成素受体MPL的结合作用52-55

摘要：目的研究人核迁移蛋白C（hNUDC）与血小板生成素受体MPL的结合作用。方法采用PCR技术，分别从人胚胎干细胞和pLexA—MPL-EC质粒中扩增hNUDC和MPL-EC基因，再分别克隆至pET-28b（＋）和pMAL—c2表达载体中，转化大肠杆菌BL21（DE3）．IPTG诱导表达hNUDC和MPL—EC蛋白。纯化后，通过MBP pull—down试验检测二者的结合作用。结果表达的融合蛋白His—hNUDC和pMAL-MPL-EC表达量分别约占菌体总蛋白的25％和30％，蛋白回收率分别可达90％和80％，纯化后的蛋白纯度分别在95％和90％以上，且均具有良好的反应原性。His—hNUDC蛋白可与MBP—MPL—EC蛋白共洗脱，二者存在结合作用。结论hNUDC蛋白可与MPL蛋白结合，可能为MPL的一种新配体。