中国生物制品学杂志 北大期刊 CSCD期刊 统计源期刊

中国生物制品学 2008年第09期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

HIV-1 Vif蛋白的体内表达及其生物学功能737-740

摘要：目的分别构建带有6His和mbptag的HIV-1Vif基因真核表达载体,在体内表达融合蛋白,并检测其生物学功能。方法PCR扩增带有6His和mbptag的HIV-1Vif基因,克隆至真核表达载体VR1012上。将抗病毒因子APOBEC3G（A3G）分别与空载体VR1012、HIV-1野生型Vif/VR1012、Vif-mbp/VR1012和Vif-6His/VR1012共同转染293T细胞,检测Vif-mbp和Vif-6His的表达,并进行A3G体内降解试验。将A3G和/或可产生病毒的质粒HXB2Neo△Vif分别与HIV-1野生型Vif/VR1012、Vif-mbp/VR1012和Vif-6His/VR1012共同转染293T细胞,通过A3G包装进病毒和Magi细胞感染试验,进一步检测HIV-1Vif-mbp和Vif-6His融合蛋白的生物学功能。结果重组表达质粒Vif-mbp/VR1012和Vif-6His/VR1012经双酶切鉴定证明构建正确。转染293T细胞48h后,Vif-mbp和Vif-6His融合蛋白均有表达,但表达的Vif-mbp有不同程度的降解。Vif-6His可降解A3G,使其表达量下降至10%左右,而Vif-mbp几乎不能降解A3G。Vif-6His可阻止A3G包装进病毒颗粒中,而Vif-mbp无此功能。Vif-mbp可使HXB2Neo△Vif病毒感染能力恢复至15%,而Vif-6His可使其恢复至86%。结论已成功构建了带有6His和mbptag的HIV-1Vif基因真核表达载体,表达的Vif-mbp融合蛋白影响了Vif的生物学功能,但Vif-6His融合蛋白不影响Vif的生物学功能。

hTERT核心启动子调控HSV-TK自杀基因系统诱导肿瘤细胞的凋亡741-745

摘要：目的观察人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子调控逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因/丙氧鸟苷（HSV-TK/GCV）自杀基因系统诱导肿瘤细胞凋亡的效果。方法采用PCR方法扩增胸苷激酶（TK）基因,并构建由hTERT核心启动子调控的胸苷激酶重组逆转录病毒载体pLNC-hTERTp-TK,转染包装细胞PT67,G418筛选阳性细胞克隆,检测病毒滴度,PCR法检测转染细胞中的TK基因。将获得的重组逆转录病毒感染人肺癌细胞株A549、肝癌细胞株SMMC-7721、宫颈癌细胞株HeLa和正常人成纤维细胞系WI-38,G418筛选阳性克隆,MTT法检测重组逆转录病毒对肿瘤细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡。结果重组逆转录病毒载体pLNC-hTERTp-TK经双酶切,可见1402bp的目的基因片段,表明质粒构建正确。从转染的PT67细胞中扩增出1131bp的基因片段,与TK基因大小一致。在成功转染重组逆转录病毒的PT67细胞中,病毒滴度最高者可达7.8×10^5CFU/ml。重组逆转录病毒感染的3种肿瘤细胞的增殖均受到抑制,且生长抑制率随着GCV浓度的增加而升高,经较低浓度GCV（10μg/ml）处理的3种肿瘤细胞,凋亡率分别可达37.06%、34.88%和33.59%。结论由hTERT启动子调控的逆转录病毒介导的HSV-TK/GCV自杀基因系统可诱导肿瘤细胞凋亡,且具有较强的特异性和高效性。

中国生物制品学杂志消息

欢迎订阅《中国生物制品学杂志》745-745

中国生物制品学杂志基础研究

用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株的构建746-748

摘要：目的利用λ噬菌体Red重组酶系统,构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株。方法采用PCR方法,将完整的噬菌体基因Ⅲ和氯霉素抗性基因拼接,使其两端带有与四环素基因同源的36nt序列;利用λ噬菌体Red重组酶系统,将其整合到大肠杆菌XL1-Blue的附加体上,以替换掉四环素基因,经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,获得包装菌株XLe-pⅢ;将基因Ⅲ缺失的噬菌体基因组导入包装菌株,制备缺陷型辅助噬菌体,集落形成试验检测缺陷噬菌体的感染能力。结果所构建的包装菌株XLe-pⅢ经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,证明氯霉素抗性基因已与噬菌体基因Ⅲ一同整合到附加体上,重组菌不能在含有氨苄西林的LB培养基中生长,仍保留四环素抗性;该包装菌株能用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体,制备的缺陷型辅助噬菌体的滴度为3.0×10^8。结论利用λ噬菌体Red重组酶系统,已成功构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株,以其制备的缺陷型辅助噬菌体有望用于常规筛选或SIP体系。

重组人抗乙型肝炎病毒表面抗体的筛选及序列分析749-751

摘要：目的克隆、筛选人抗乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs）,并对其基因序列进行分析。方法从抗-HBs抗体阳性血液中分离淋巴细胞,提取总RNA,合成cDNA,以此为模板,PCR扩增轻链和重链抗体可变区基因;应用已构建的抗体支架载体,构建重组表达载体,转化毕赤酵母X33,建立相应的酵母表达文库;甲醇诱导表达,Westernblot及ELISA筛选抗-HBs抗体阳性菌株;PCR扩增DN段,进行测序及Blastn比对,并与已发表的抗-HBs抗体序列进行同源性分析。结果重链及轻链抗体重组表达载体经双酶切鉴定,证明构建正确;经Westernblot及ELISA筛选,获得了具有HBsAg结合活性的完整轻重链抗体;轻链可变区与已发表序列核苷酸同源性为93%,而氨基酸同源性仅为88%,尤其CDR3变异较大;重链可变区与已发表序列同源性较低,CDR3区基因长度及序列均有较大差别。结论应用毕赤酵母表达体系筛选,获得了新的抗-HBs抗体。

天蚕素A-蛙皮素杂合肽突变体的构建、表达及其抗菌活性752-755

摘要：目的构建天蚕素A（1～8）-蛙皮素（1～12）杂合基因抗菌肽（CA-MA杂合肽）突变体,在大肠杆菌中融合表达,并进行抗菌活性检测。方法采用PCR体外定点突变技术,设计1对方向相反的引物,其中1个引物引入突变点,应用高保真的PolybestDNA多聚酶进行重组表达质粒pGEX-4T-1-CA-MA的PCR扩增,使CA-MA杂合肽第16位密码子由AGT突变为TGG。将扩增片段自身连接,构建CA-MA杂合肽突变重组表达质粒pGEX-4T-1-W16-CA-MA,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达突变体蛋白W16-CA-MA,并对表达产物进行纯化。分离GST融合蛋白后,进行抗菌活性检测。结果重组突变表达质粒DNA测序结果表明,在预期位点发生了突变;突变蛋白在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的18%;纯化后蛋白纯度可达75%以上,并具有一定的抗菌活性。结论已成功获得了具有抗菌活性的杂合肽突变体W16-CA-MA。

口蹄疫病毒2B基因绿色荧光蛋白融合表达质粒的构建及表达756-758

摘要：目的构建口蹄疫病毒（FMDV）2B基因绿色荧光蛋白（GFP）融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。方法RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒WFL株的2B基因,克隆入表达载体pEGFP-C1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和2B基因转录水平。结果经双酶切及PCR鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与WFL株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有2B基因的转录。结论已成功构建了FMDV2B基因GFP融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。

激活素A对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬活性的促进作用759-761

摘要：目的探讨激活素A对巨噬细胞吞噬活性的促进作用及其机制。方法分别通过中性红试验、鸡红细胞法和流式细胞术,检测激活素A对巨噬细胞系RAW264.7细胞的吞饮活性、吞噬活性以及对MHCⅠ、Ⅱ类分子和CD68表达的影响。结果激活素A可明显促进RAW264.7细胞的吞饮及吞噬活性,对MHCⅠ、Ⅱ类分子表达没有影响,但可明显上调巨噬细胞表面分子CD68的表达。结论激活素A可促进巨噬细胞系RAW264.7细胞吞噬活性,这与其促进巨噬细胞成熟有关。

重叠PCR技术在构建sodAP基因表达载体中的应用762-764

摘要：目的应用重叠PCR技术,构建节杆菌DMDC12的Mn-SOD基因sodAP的重组表达质粒,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法设计两对引物,分别扩增启动子P121和sodAP基因序列,利用重叠PCR技术,将启动子P121与sodAP基因相连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pET-22b（＋）,构建重组质粒pET-PsodAP,转化E.coliBL21（DE3）进行表达。用SDS-PAGE检测表达产物,光密度定量分析法分析目的蛋白表达量。结果启动子P121和sodAP基因的连接产物经凝胶电泳检测,可见约800bp的目的条带,测序结果与预期相符;重组表达质粒pET-PsodAP经双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21（DE3）中获得了表达,表达量占菌体总蛋白的19%。结论应用重叠PCR技术,成功构建了sodAP基因的重组表达质粒,并在E.coliBL21（DE3）中获得表达,为Mn-SOD的进一步工业化生产奠定了基础。

Cyclin A-Cdk2对B细胞成熟因子的体外磷酸化作用765-767

摘要：目的原核表达并纯化仅含BH3结构域的细胞凋亡调控蛋白BMF,并进行CyclinA-Cdk2特异性底物的体外磷酸化检测。方法从HeLa细胞中扩增人源BMF基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物经Glutathione Sepharose 4B凝胶柱亲和层析纯化。以纯化的融合蛋白GST-BMF作为底物,免疫共沉淀得到的CyclinA-Cdk2作为酶源,并以Cdk2的已知底物HistoneH1作为阳性对照,进行体外磷酸化试验。结果BMF基因的原核表达载体构建正确,表达的融合蛋白GST-BMF约占菌体总蛋白的40%,纯化后纯度约为90%。在体外磷酸化试验中,未出现与目的蛋白GST-BMF相对分子质量相近的放射自显影带。结论BMF蛋白在无细胞体系中不能被CyclinA-Cdk2磷酸化。

KDRn3蛋白在人脐静脉血管内皮细胞中的表达及对其增殖的抑制作用768-770

摘要：目的观察KDRn3蛋白在人脐静脉血管内皮细胞中的表达及对其增殖的抑制作用。方法将质粒pEGFP-N1/KDRn3扩增并鉴定后,以脂质体介导转染人脐静脉血管内皮细胞,培养一定时间后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,ELISA检测细胞培养上清中KDRn3的含量,MTT法检测KDRn3蛋白对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响。结果转染后48h,在荧光显微镜下可见pEGFP-N1/KDRn3转染组人脐静脉血管内皮细胞发出绿色荧光,72h发出绿色荧光的细胞增多,强度增强;转染后24、48和72h,细胞培养上清中KDRn3含量与转染前比较均提高,且差异有显著意义;转染后48和72h,pEGFP-N1/KDRn3转染组与对照组比较,细胞增殖有明显的抑制,且差异有显著意义。结论KDRn3蛋白可在人脐静脉血管内皮细胞中表达,并能抑制其增殖。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因的克隆及其高效表达771-773

摘要：目的克隆幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（UreB）基因,构建原核表达载体,并进行高效表达。方法以幽门螺杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增UreB基因,双酶切后,与质粒pET-22b（＋）连接,构建表达载体pET-22b（＋）/UreB,分别转化E.coliBL21（DE3）、Origam（iDE3）和Rossetta（DE3）,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果经酶切及测序,证明幽门螺杆菌UreB基因的原核表达载体构建正确。3种重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,均可见相对分子质量为64000的目的蛋白条带,Rossetta（DE3）重组菌目的蛋白表达量最高,约占菌体蛋白的35%。Western blot结果表明,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了幽门螺杆菌UreB基因,并在大肠杆菌Rossetta（DE3）中获得了高效表达。

不同代次F基因型SP-A株腮腺炎病毒在恒河猴体内的致病性774-776

摘要：目的观察不同代次F基因型SP-A株腮腺炎病毒在恒河猴体内的致病性。方法选取腮腺炎病毒SP-A株在KMB17细胞上传至15、20、30代的活病毒作为实验组,在Vero细胞上传至第2代的病毒作为野毒株对照组,分别接种恒河猴腮腺。观察实验动物体温和临床体征。活体取双侧腮腺,进行组织病理检查,并检测腮腺炎病毒中和抗体。结果对照组动物出现了明显的体温升高,一般状况较差,注射后第5天出现腮腺肿大,组织病理检查表现为淋巴细胞大量浸润。而各实验组动物均未出现腮腺炎症状和明显的组织病理学变化。各组动物接种病毒后均能产生抗腮腺炎病毒的中和抗体,但对照组的中和抗体GMT水平均高于各实验组。结论腮腺炎病毒SP-A株传至第15代次,已无致腮腺炎发病能力,为开发F基因型腮腺炎病毒减毒活疫苗奠定了基础。

重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌生物学特性的稳定性777-779

摘要：目的观察重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌pKKH-BLyS/DH5α生物学特性的稳定性。方法工程菌连续传50代,每10代进行目的蛋白表达水平、质粒性状检测、透射电镜观察、革兰染色及各项生化检查,观察工程菌生物学特性的稳定性。结果0、10、20、30、40和50代工程菌之间目的蛋白的表达量无明显差异,基本维持在40%左右;双酶切、PCR及测序结果均与原代质粒相符;革兰染色均呈阴性;透射电镜观察及各项生化反应均呈现典型的大肠杆菌特性。结论该菌种生物学特性稳定,可作为生产用菌种。

中国生物制品学杂志消息

《英汉-汉英生物制品学词汇》即将出版779-779

中国生物制品学杂志基础研究

快速检测农药残留用大豆酯酶的稳定性780-781

摘要：目的观察用于快速检测农药残留的大豆酯酶的稳定性,确定其最适保存条件。方法分别测定不同温度、不同酸碱度和不同保护剂对大豆酯酶酶活力的影响。结果在4℃保存30d,酶活力损失较少;在-20℃保存30d,完全失活;温度在50℃以下,pH在6.0～9.0保存10min,酶活力无明显变化;保护效果好的保护剂依次为牛血清白蛋白（BSA）、蔗糖和甘油。结论已确定大豆酯酶最适保存条件。

中国生物制品学杂志预防制品

乙肝乙脑麻疹多表位噬菌体疫苗的构建及其免疫原性782-785

摘要：目的构建乙肝乙脑麻疹多表位噬菌体疫苗,并检测其免疫原性。方法将PCR方法合成的乙肝乙脑麻疹多表位基因COM插入T7噬菌体基因组中,使其与噬菌体10B蛋白融合,展示在T7噬菌体表面,构建成多表位噬菌体疫苗COM/T7。分别以1010pfu/只和1012pfu/只两种剂量,通过腹腔、皮下和鼻腔3种途径免疫昆明小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体水平。结果重组噬菌体COM/T7经PCR鉴定证明构建正确。乙肝乙脑麻疹多表位噬菌体疫苗能诱导小鼠产生针对各表位的特异性IgG抗体。在3种免疫途径中,腹腔免疫效果最好。免疫剂量与诱导的抗体水平在一定范围内呈正相关。多表位噬菌体疫苗诱导的抗-HBs和抗-JEV水平高于常规疫苗,而抗-MV水平低于常规疫苗。结论构建的乙肝乙脑麻疹多表位噬菌体疫苗具有良好的免疫原性。

CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性786-787

摘要：目的研究人用狂犬病病毒CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性,为评估该疫苗的适用性提供依据。方法用CTN株疫苗免疫昆明小鼠,用3株具有代表性的街毒株CQ92、HN06、J和标准攻击毒株CVS经脑内和肌肉攻击,以未免疫小鼠进行脑内和肌肉攻击为对照,观察CTN株疫苗的保护效果。结果原倍和5倍稀释的疫苗免疫的小鼠经3株街毒肌肉攻击后,均得到100%的保护,与对照组比较,差异均有极显著意义;经3株街毒脑内攻击后,原倍疫苗免疫的小鼠均得到100%的保护,5倍稀释的疫苗免疫的小鼠对3株街毒CQ92、HN06、J的保护率分别为85%、75%和77.8%,与对照组比较,差异均有极显著意义。结论CTN株疫苗总体上能有效预防我国目前狂犬病的流行。