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中国生物制品学 2008年第08期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

人白细胞介素-18突变体的虚拟筛选及其活性641-646

摘要：目的筛选合适的人白细胞介素-18（hIL-18）突变体，并检测其活性。方法运用分子模建工具，模建出IL-18受体及IL-18／IL-18R复合物的分子结构，分别虚拟突变IL-18的4个半胱氨酸为另外19种氨基酸，以野生型IL-18为模板进行同源模建，建立其三维结构模型，计算其IL-18／IL-18R复合物三维结构及分子间作用能变化情况，筛选几种突变方案。运用分子生物学技术构建突变体，表达纯化后进行活性检测。结果根据理论预测情况，筛选了12株突变体。突变的质粒经双酶切及测序鉴定，证明构建正确。突变体蛋白以包涵体形式表达，表达量约占菌体总蛋白的30％，纯化后纯度大于90％。纯化的C38Glu、C127Ser等几株突变体在低浓度时，活性轻微上升，与理论预测结果基本相同。结论已成功构建了多株IL-18的突变体，运用生物信息学方法进行先期筛选有助于加快IL-18的突变研究。

大容量人源天然噬菌体抗体库的构建647-650

摘要：目的构建大容量（〉10^8）的人源天然噬菌体抗体库。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA，反转录出cDNA第一链，以此为模板，PCR扩增重链（VH）和轻链（VL）基因片段。将VL基因PCR产物插入含Loxp和Loxp511序列的pDF载体中，电转化大肠杆菌XL1-Blue，构建轻链库，再将VH基因PCR产物插入轻链库载体中，电转化大肠杆菌XL1-Blue，构建初级库。进一步用初级库超感染BS1365菌，使其VH与VL发生重组，获得重组库，再利用重组库感染大肠杆菌XL1-Blue，构建工作库。结果所有VL和VL亚类基因的扩增产物片段大小均与理论值相符，轻重链基因的克隆效率均为100％。初级库容量为10^8，滴度为6×10^13；重组后的工作库有效容量为8×10^10，滴度至少为1×10^13。结论已构建容量为10m的人源天然噬菌体抗体库。

中国生物制品学杂志消息

征稿650-650

中国生物制品学杂志基础研究

新城疫病毒自然宿主细胞膜受体的鉴定651-653

摘要：目的鉴定鸡源副黏病毒F48E9株的自然宿主细胞膜受体。方法采用蛋白膜提取试剂盒提取鸡胚成纤维细胞膜蛋白，用改进的间接ELISA方法检测鸡源副黏病毒分离株F48E9与细胞膜的结合活性，利用病毒铺覆蛋白印迹技术（VOPBA）鉴定新城疫病毒（NDV）的自然宿主细胞膜受体。结果NDV与鸡胚成纤维细胞膜有很强的结合力，在转印鸡胚成纤维细胞膜蛋白的PVDF膜上有几条明显的疑似受体条带，相对分子质量介于35000～60000之间。结论初步鉴定了NDV自然宿主细胞膜的受体，其疑似受体蛋白的性质及在新城疫病毒致病中的作用尚有待进一步研究。

中国生物制品学杂志消息

《中国医药导刊》（双月刊）欢迎订阅、欢迎投稿、欢迎刊登广告653-653

中国生物制品学杂志基础研究

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在CHO细胞中的稳定表达654-657

摘要：目的在CHO细胞中稳定表达水痘．带状疱疹病毒（VZV）糖蛋白E（gE）。方法PCR扩增VZVgE完整胞外结构域编码基因，克隆至哺乳动物细胞表达质粒PSGHVO中，与DHFR选择性基因和脂质体共转染CHO／dhfr^-细胞，筛选稳定分泌人生长激素（hGH）和gE融合蛋白的细胞株。采用ELISA和Western blot方法检测细胞培养上清中hGH和gE融合蛋白的表达，并用Ni^2＋-NTA柱进行纯化。结果gE基因PCR扩增产物和重组表达质粒PSGHVO-gE的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，均可见1500bp的目的基因条带。转染PSGHVO-gE质粒和DHFR基因的细胞培养上清液经ELISA和Western blot，确认有重组蛋白表达，gE表达量约为20mg／L；纯化后蛋白纯度约为90％。结论已在CHO细胞中稳定表达了VZV gE蛋白，为制备VZV表面抗原奠定了基础。

共表达口蹄疫病毒O型P1-2A-IL-18基因和Asia I型P1-2A-3C基因重组鸡痘病毒的构建658-661

摘要：目的构建共表达口蹄疫病毒（FWDV）O型P1-2A-IL-18基因和Asia I型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。方法将酶切得到的FWDVO型P1-2A-IL-18基因和Asia I型P1-2A-3C基因克隆至鸡痘病毒表达载体pUTAL上，构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18，与鸡痘病毒（FPV）282E4株共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），通过BrdU3次加压筛选，挑选出单克隆重组病毒株，进行RT-PCR及间接免疫荧光（IFA）鉴定。结果重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18经双酶切鉴定证明构建正确。经RT-PCR和IFA鉴定，证明所筛选的重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C-P1-2A-IL-18基因盒。结论已成功构建了共表达FMDVO型P1-2A-IL-18基因和Asia I型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。

中国生物制品学杂志消息

生物制品细菌与细胞培养的新进展及新技术研讨会661-661

中国生物制品学杂志基础研究

抑制新城疫病毒繁殖的九肽及其突变体基因的克隆与原核表达662-664

摘要：目的克隆并表达抑制新城疫病毒（NDV）繁殖的九肽（Nonapeptide）及其突变体基因。方法设计并合成Nonapeptide 2串联体及其突变体基因，克隆于质粒pUC18，经酶切回收目的基因，与经相同酶切的表达载体pGEx-4T-1连接，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性菌落，抽提质粒进行鉴定。IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定，证明构建正确。阳性重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析，在相对分子质量约29000处可见一明显条带，与理论值相符。Nonapeptide 2及其突变体蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的41％和37％。Western blot结果显示两种蛋白均具有良好的反应原性。结论已成功克隆并表达了抗NDV繁殖的Nonapeptide及其突变体基因。

前列腺特异性抗原体外诱导结肠癌特异性CTLs665-668

摘要：目的检测前列腺特异性抗原（PSA）在结肠癌中的表达水平，探讨PSA作为结肠癌主动免疫治疗新靶点的可能性。方法用RT-PCR方法检测结肠癌细胞系中PSA mRNA的表达水平；免疫组织化学方法检测结肠癌细胞中PSA蛋白的表达水平。利用PAP表位肽对结肠癌患者的PBMCs进行体外诱导，ELISA法检测PSA特异性IFN-γ分泌水平；51Cr释放法检测PSA多肽特异性CTLs对结肠癌细胞的细胞毒性。结果4种结肠癌细胞（colo201，colo205，SW480和SW620）表达PSA mRNA和PSA蛋白。HLA-A＋24结肠癌患者的PBMCs经体外诱导产生的CTLs可特异性杀伤HLA-A24^＋／PSA＋的结肠癌细胞，CTLs的细胞毒活性依赖于CD8^＋的T淋巴细胞。结论结肠癌患者的外周血中存在PSA特异性CTLs前体细胞，PSA有可能成为结肠癌特异性免疫治疗的靶点。

健康牙齿和龋齿成牙本质细胞中MMP-2和MMP-9的活性669-671

摘要：目的比较健康牙齿和龋齿成牙本质细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的活性，以探讨MMP-2和MMP-9在龋病发病机制中的作用。方法培养健康牙齿和龋齿成牙本质细胞，利用酶谱分析细胞培养上清中MMP-2和MMP-9的活性。结果龋齿组中MMP-2和MMP-9的活性显著高于健康组。结论MMP-2和MMP-9在健康牙齿和龋齿成牙本质细胞中的活性不同，提示MMPs可能在龋病的进展过程中发挥作用。

RhoC基因沉默对肝癌细胞Bel7402凋亡和迁移的影响672-674

摘要：目的研究RhoC基因沉默对肝癌细胞Bel7402凋亡和迁移的影响。方法以RNAi沉默Bel7402细胞RhoC基因的表达，FACS和RT-PCR检测细胞凋亡和凋亡相关基因水平，细胞划痕损伤和软琼脂克隆形成试验检测细胞迁移和生长特性。结果RNAi组细胞凋亡率明显高于细胞对照组，RNAi组Bcl-2表达水平明显低于细胞对照组，只有RNAi组可检测到Bax基因的表达。两对照组细胞划痕损伤在48h内愈合，而RNAi组则不能修复。RNAi组软琼脂克隆形成能力明显低于两对照组。结论RhoC基因沉默能够促进肝癌细胞Bel7402凋亡并抑制细胞迁移和非锚定生长能力。

中国生物制品学杂志消息

欢迎订阅《中国生物制品学杂志》674-674

中国生物制品学杂志基础研究

原发性开角型青光眼致病基因MYOC真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达675-678

摘要：目的构建原发性开角型青光眼（POAG）致病基因MYOC的真核表达质粒，并在COS-7细胞中表达MYOC蛋白。方法用RT-PCR法扩增人眼组织（角膜缘）MYOC基因cDNA，纯化回收后，克隆入pGEM-T载体，再亚克隆入真核表达质粒pEGFP-N3，构建重组表达质粒pEGFP-N3-MYOC，转染COS-7细胞，用荧光显微镜观察MYOC蛋白在COS-7细胞中的表达，Western blot分析MYOC蛋白分泌特点。结果经酶切和DNA测序鉴定，证实重组表达质粒pEGFP-N3-MYOC构建正确，荧光显微镜观察MYOC蛋白能在COS-7细胞中表达，并且定位在细胞质中，而绿色荧光蛋白分布在整个细胞内。Western blot结果显示，MYOC蛋白能分泌到细胞外。结论已成功构建MYOC基因真核表达质粒，并能在COS-7细胞中表达MYOC蛋白，为进一步研究POAG发病机制奠定了基础。

鼠抑铁素2蛋白的原核表达及鉴定679-682

摘要：目的表达鼠抑铁素2（lcn2）蛋白，并检测表达产物的生物学活性。方法从小鼠RAW264.7巨噬细胞提取总RNA，逆转录合成eDNA，以eDNA为模板，PCR扩增lcn2基因片段，插入原核表达质粒pET-32a（＋），转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS，用IPTG诱导表达。表达产物经His-tagin-gelstain鉴定后，采用Ni^2＋-NTA亲和层析纯化，并检测其生物学潘陛。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定，表明重组质粒pET-32a（＋）．lcn2构建正确。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析，相对分子质量约为21000，表达量占菌体总蛋白的35％，主要以包涵体形式存在。纯化后蛋白浓度为1．0g／L，并对大肠杆菌和乙型链球菌生长有一定的抑制作用。结论成功地在原核细胞中表达了重组lcn2蛋白，且表达的蛋白具有一定的抑菌作用。

哺乳期大鼠大量摄入酒精对子代成年期胰岛素敏感性的影响683-686

摘要：目的观察哺乳期大鼠大量摄入酒精对子代成年期胰岛素敏感性的影响。方法将Wistar雌鼠哺乳期酒精灌胃4g／kg·d，对照组给予等容积蒸馏水。子代出生后，每周测量体重1次，断乳后1周开始测量进食量；对第16周龄子代雄性鼠进行静脉葡萄糖耐量试验；Western blot检测骨骼肌细胞膜葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）含量；酶学法测定血浆和骨骼肌甘油三酯（TG）含量。结果哺乳期大鼠摄入酒精对后代生长发育无明显影响。与对照组比较，哺乳期大鼠摄入酒精的子代鼠16周龄时，葡萄糖耐量降低，血糖曲线下面积增加，胰岛素敏感指数（S1）、处置指数（DI）及葡萄糖耐量指数（KG）均明显降低，但葡萄糖效应指数（SG）与对照组比较，差异无显著意义，葡萄糖刺激的胰岛素快速反应分泌总量差异亦无显著意义；哺乳期大鼠摄入酒精的子代鼠，骨骼肌细胞膜GLUT4含量、血浆及骨骼肌TG含量与对照组比较，差异均无显著意义。结论哺乳期大鼠大量摄入酒精可引起后代成年期发生胰岛素抵抗，其发生机制与骨骼肌GLUT4转位及TG含量无关。

中国生物制品学杂志预防制品

白喉毒素无毒变异体CRM197的表达及其载体作用687-691

摘要：目的表达白喉毒素无毒变异体CRM197并考察其载体作用。方法利用基因工程技术在大肠杆菌BL21（DE3）中表达CRM197用金属镍离子亲和层析纯化；以重组CRM197为蛋白载体，在EDAC的作用下，与活化的A群脑膜炎球菌荚膜多糖（GAMP）结合，制备GAMP-rCRM197结合物，免疫BALB／c小鼠，间接ELISA法测定血清中A群脑膜炎球菌多糖特异性IgG抗体，并分析其免疫原性。结果重组CRM197在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达，表达量占菌体总蛋白的25％左右；Western blot证明重组CRM197具有良好的反应原性；各针接种后，结合物诱生的多糖特异性IgG水平均显著高于GAMP组和GAMP＋rCRM197混合物组，具有较强的免疫原性；多次接种产生了免疫增强效应，重组CRM197具有载体蛋白的作用。结论已在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了重组CRM197以纯化的重组CRM197作为载体制备的GAMP-rCRM197结合物具有良好的免疫原性，为以重组CRM197为蛋白载体制备其他结合疫苗奠定了实验基础。

山东日照市接种流感疫苗的成本-效益分析692-693

摘要：目的对山东日照市接种流感疫苗的成本-效益进行分析，为开展流感疫苗接种工作提供科学依据。方法在流感流行后，对该市部幼儿园、学校、企业和敬老院的疫苗接种率、各类疾病和呼吸系统疾病的就诊率和住院率及医疗费用等进行调查，并对调查结果进行成本-效益分析。结果调查对象共3830人，其中接种疫苗2692人，接种率为70．29％。接种组与未接种组比较，各类疾病和呼吸系统疾病的就诊率和住院率均明显下降，医疗费用也有不同程度的下降，其中以儿童和老年人最为明显。各年龄组合计，接种疫苗控制各类疾病的BCR为1．28，呼吸系统疾病为0．77。结论接种流感疫苗可明显降低就诊率和住院率，节省医疗费用，特别是对儿童和老年人。