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中国生物制品学 2008年第06期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

LTB—MOMP融合基因表达载体的构建及其在原核细胞中的表达449-451

摘要：目的构建含大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位（LTB）和鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白（MOMP）融合基因（LTBMOMP）的表达载体，并在原核细胞中表达融合蛋白。方法应用PCR从质粒EWD299和鹦鹉热衣原体中扩增LTB和MOMP基因，经与柔性肽连接后，插入pET-28a载体中，酶切鉴定正确后，转化大肠杆菌Rosetta，IPTG诱导表达，并纯化目的蛋白。SDSPAGE和Western blot分析外源蛋白的表达及表达产物的抗原特异性。结果重组工程菌可以表达相对分子质量约为54000的LTB-MOMP融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的42％，LTB-MOMP融合蛋白具有良好的抗原特异性。结论已成功构建了LTB-MOMP融合基因表达载体，并在原核细胞中获得表达。

复合通用CD4^＋Th细胞表位基因的原核表达及免疫学特性452-456

摘要：目的构建复合通用CD4^＋h细胞表位基因的原核表达载体，检测表达蛋白的免疫学特性，并探讨其作为载体蛋白的可能性。方法以限制性核酸内切酶BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切重组质粒pUC19-Pep10，回收长度为650bp左右的目的片段，插入原核表达载体pQE30中，获得重组质粒pQE30-Pep10，转化大肠杆菌M15后进行诱导表达。表达产物经SDS—PAGE和Western blot分析后，进行亲和层析纯化及透析复性，获得重组蛋白Pep10，将Pep10和TT分别免疫雌性BALB／c小鼠，以间接EMSA法和流式细胞术分别检测其免疫原性和淋巴细胞增殖效应。结果SDS—PAGE显示重组蛋白Pep10相对分子质量约为23000，表达量达41％，主要以包涵体形式表达，Western blot检测可见特异性染色条带，纯化后纯度达94％，共获得42mg重组蛋白。其体外淋巴细胞增殖效应与TT相当，增殖指数分别为4．216和4．736，而免疫原性远低于TT，特异性IgG几何平均滴度（GMT）分别为1：15758．65和1：67558．81。结论已成功构建重组原核表达载体pQE30-Pep10，并在大肠杆菌中高效表达，且表达的重组蛋白Pep10具有良好的淋巴细胞增殖效应和较低的免疫原性，有可能作为一种新型载体蛋白，用于多糖结合疫苗的研制。

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达457-459

摘要：目的克隆HIV-1 Vif基因编码区序列，并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI，将Vif基因序列克隆至该载体中，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，菌体裂解后获得特异性表达蛋白，用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白，并经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果表达质粒pMRI—Vif经双酶切，可见约600bp的Vif基因片段，测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达了可溶性Vif蛋白，纯化后经凝胶自动扫描分析，纯度达85％以上，蛋白浓度约为1g／L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。

中国生物制品学杂志消息

征稿459-459

中国生物制品学杂志基础研究

武汉地区呼吸道合胞病毒分离株的G蛋白基因遗传特征460-462

摘要：目的分析武汉地区人呼吸道合胞病毒（RSV）分离株的G蛋白基因的遗传特征。方法使用不同的特异性引物，对武汉地区2006年分离的9株RSV进行G基因3′末端第2个高变区的序列测定，并进行基因分型和基因亲缘关系分析。结果分离的9株RSV中，33．3％（3／9）为A亚型，属GA2基因型；66．7％（6／9）为B亚型，其中1株属于BA基因型，5株属于GB8基因型。9株RSVG蛋白与原型株核苷酸同源性为84．5％～99．0％，且与原型株相比，在205～230位氨基酸中有5～8个位点氨基酸变异，还存在糖基化位点的改变。结论2006年初在武汉地区存在着由不同RSV株引起的传播链，A、B亚型共循环，B亚型是优势流行亚型；9株RSVG蛋白与原型比较，存在明显的差异。

1株肠道高黏附性乳杆菌的分离鉴定463-466

摘要：目的从人的肠道中分离具有高黏附性能的益生乳酸菌，为其应用于临床研究提供依据。方法采用改良的LAMVAB选择性培养基，取肠黏膜活检标本进行分级分离。对分离的乳酸菌进行生理、生化鉴定和16S rRNA序列测定，并对其耐酸、耐胆盐特性、黏附性能以及抑菌特性等进行分析。结果从人肠黏膜活检标本中分离出1株乳酸菌L2，该菌能在改良的LAMVAB选择性培养基上生长，并能抵抗pH2．5的酸性环境和0．3％的高胆盐环境；体外黏附试验显示，该菌株具有较好的黏附性能，对人肠上皮样细胞Caco-2和大鼠小肠上皮细胞IEC-6的黏附指数分别达（595±125．76）／100cells和（538±65．2）／100cells，且黏附具有Ca^2＋依赖性。对大肠杆菌、铜绿假单胞菌等具有较强的抑制作用，对益生菌鼠李糖乳杆菌LGG和嗜酸乳杆菌L05013-12无抑制作用。该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。结论植物乳杆菌L2具有较好的黏附性能，且耐酸、耐胆盐性能以及抑菌特性均较佳，具备作为益生菌使用的潜能。

颗粒裂解肽G13结构域的表达及其对大肠杆菌活力的影响467-470

摘要：目的构建携带颗粒裂解肽G13结构域的原核表达质粒，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达目的蛋白，并检测其对大肠杆菌活力的影响。方法人工合成G13结构域编码DNA序列，PCR扩增后，用T-A克隆法与pBAD／TOPO ThioFusion表达载体连接。通过PCR鉴定及测序筛选阳性重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3），经阿拉伯糖诱导表达，SDS-PAGE检测表达情况，同时监测诱导表达前后工程菌A600值的变化及菌液中的突变体。结果工程菌经诱导，表达出相对分子质量约15000的特异蛋白，表达量占菌体总蛋白的3％左右。随着外源蛋白的表达，菌液A600值下降，随后又缓慢上升。提取的质粒测序结果表明，其启动子的-35区和-10区均发生了突变，随着诱导时间的增加，突变细胞的比例不断增加。结论已成功构建了G13结构域原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出G13融合蛋白。该异源蛋白的表达导致工程菌的活力降低。

重组靶向毒素IL-6（23）-PE40KDEL在毕赤酵母中的表达及其活性471-474

摘要：目的利用毕赤酵母表达系统表达IL-6（23）-PE40KDEL重组靶向毒素，并检测其杀伤肿瘤细胞的活性。方法采用PCR技术，将目的基因IL-6（23）-PE40KDEL插入到pPIC9载体中SnaBⅠ与NotⅠ位点，电转化至巴斯德毕赤酵母GS115中，筛选Mut型重组酵母；甲醇诱导表达，体外细胞试验检测其细胞毒性。结果获得12株Mut-重组酵母，其中8株具有细胞毒性，表达产物占上清液蛋白的9％～12．7％；15μl以上的表达产物在体外对SP2／0、HL-60、HepG2、BGC-832和HCT-116细胞具有高度杀伤活性，对CK、HeLa和NIH／3T3细胞无明显影响。结论IL-6（23）-PE40KDEL重组靶向毒素在毕赤酵母GS115中获得表达，并具有选择杀伤肿瘤细胞的活性。

RTA和RTA-KEEL／KDEL基因的表达及细胞毒性475-478

摘要：目的构建蓖麻毒素A链（RTA）和RTA-KEEL／KDEL基因表达载体，并检测重组蛋白的细胞毒性作用。方法用PCR法从蓖麻毒素基因组中扩增出RTA及RTA-KEEL／KDEL基因，连接T载体，测序正确后，定向插入质粒pET．28a（＋）中，构建重组表达质粒pET-28a-RTA和pET-28a-RTA-KEEL／KDEL，转化感受态E.coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，并对表达产物进行鉴定。结果所表达的RTA及RTA—KEEL／KDEL非融合蛋白经SDS-PAGE分析，相对分子质量约为31000，Western blot分析具有反应原性，MTS法检测，RTA-KEEL／KDEL对CHO细胞具有比RTA更强的杀伤作用。结论已成功构建RTA和RTA-KEEL／KDEL表达载体，表达的重组蛋白具有生物学活性。

重组蛹虫草超氧化物岐化酶脱辅基蛋白的表达、纯化及其活性重建479-482

摘要：目的表达并纯化重组蛹虫草超氧化物歧化酶脱辅基蛋白，并考查各种金属离子对其活性重建的作用。方法用不含Cu^2＋和Zn^2＋的培养基培养重组菌株，并表达重组蛋白，采用DEAE—FF和CM-52进行纯化；在脱辅基蛋白溶液中加入Cu^2＋、Mn^2＋、Mg^2＋、Ni^2＋或Ag^＋，测定SOD酶活力的变化。结果蛹虫草脱辅基Cu，Zn-SOD在不含Cu^2＋和Zn^2＋的培养基中得到表达，纯化后的样品经SDS-PAGE分析，在相对分子质量17000处出现单一条带，经活性电泳分析无酶活力；脱辅基蛋白活性重建的最适宜Cu^2＋浓度为0．005mmol／L，但其紫外吸收图谱与天然SOD不同；0．1mmol／L的Mn^2＋、Mg^2＋、Ni^2＋、Ag^＋重建的酶活力远低于Cu^2＋重建的cm—SOD的酶活力。结论已成功表达并纯化了蛹虫草脱辅基Cu，Zn-SOD，各种金属离子只能有限地重建脱辅基Cu，Zn-SOD的活性。

人巨细胞病毒pp65基因在毕赤酵母中的表达483-485

摘要：目的构建表达人巨细胞病毒（HCMV）pp65336-507基因的毕赤酵母工程菌。方法扩增HCMVpp65336-507基因，构建重组表达质粒pPIC9／（pp65336-507，转化毕赤酵母菌GS115。PCR法筛选阳性克隆，SDS—PAGE及Western blot鉴定表达产物。结果已构建和筛选到阳性表达克隆株，表达的pp65336-507蛋白的相对分子质量约为26000，能与特异的pp65抗体结合。结论已成功构建了分泌表达pp65336-507蛋白的毕赤酵母工程菌，表达的目的蛋白具有良好的反应原性。

中国生物制品学杂志消息

欢迎订阅《中国生物制品学杂志》485-485

中国生物制品学杂志基础研究

乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原重组毕赤酵母表达菌株的基因和表达稳定性486-488

摘要：目的研究同时表达SS1、SS2两种多肽（含前S1、前S2和S三种抗原成分）的重组毕赤酵母工程菌株（GS115-SS1S2）基因和表达的稳定性。方法取工程菌原代种子，连续传代至30代，提取15和30代工程菌基因组DNA，PCR分别扩增SS1和SS2基因片段，克隆到pBluescript ⅡSK（＋）载体中，进行基因序列测定。对第5、10、15、20、25、30代菌种进行培养和诱导，制备抗原粗提液，并用ELISA法检测其中的前S1、前S2和S的抗原性，同时用RPHA法检测抗原效价。结果第15和30代菌种基因组中SS1和SS2基因序列与原始菌种完全一致，第5、10、15、20、25、30代菌种表达产物的前S1、前S2和S抗原均为阳性；菌种传至20代，抗原滴度无变化，25代和30代菌种抗原滴度有一定程度下降。结论重组毕赤酵母工程菌GS115-SS1S2在20代传代过程中，基因和表达稳定性良好。

重组人B7-H4IgV融合蛋白的表达、纯化及活性489-492

摘要：目的表达、纯化重组人B7-H4IgV融合蛋白，并检测其活性。方法将人B7-H4胞外片段IgV区基因插入pQE-30原核表达载体，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达。表达产物经Ni^2＋-NTA柱亲和层析纯化，并进行Western blot鉴定。用纯化的rhB7-H4IgV蛋白免疫昆明小鼠，经ELISA、流式细胞术测定小鼠抗血清的活性；免疫SP2／0荷瘤小鼠，观察对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果表达的rhB7-H4IgV蛋白约占菌体总蛋白的25％，纯化后蛋白纯度为93％，浓度约为0．5mg／ml，与抗His单抗可产生特异性反应条带。免疫昆明小鼠产生的抗血清效价可达1：10000，可与SP2／0肿瘤细胞结合。rhB7-H4IgV蛋白对SP2／0移植瘤生长具有一定的抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组人B7-H4IgV融合蛋白，纯化蛋白可诱发小鼠体内免疫应答，产生的抗体能与表达B7-H4的肿瘤细胞SP2／0结合，rhB7-H4IgV蛋白在一定程度上能抑制SP2／0移植瘤的生长。

幽门螺杆菌HpaA重组蛋白的表达及免疫效果检测493-496

摘要：目的表达幽门螺杆菌hpaA基因的重组蛋白，并检测其抗原性和免疫原性。方法用PCR方法从H．pytori DNA中扩增hpaA基因片段，插入原核表达载体pQE-30，转化大肠杆菌DH5α，进行诱导表达，SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式，Ni^2＋-NTA树脂纯化后，用Western blot鉴定其反应原性。用重组蛋白免疫家兔，检测其免疫原性。用重组蛋白免疫小鼠，分别检测胃黏膜、PP细胞悬液及小肠黏液中的IgG和sIgA的含量。结果重组表达质粒pQE30-hpaA构建正确，所得序列完整，插入的基因片段全长783bp，与基因文库中的hpaA基因同源性达97．3％。表达产物相对分子质量为30000，目的蛋白表达量占全菌总量的31．67％，主要存在于碎菌后上清中，纯度在90％以上。Western blot显示该蛋白可与病人血清特异性结合，免疫血清能与重组蛋白反应，双扩散效价为1：16。小鼠体内IgG、IgA、sIgA含量明显高于PBS对照组。结论已获得高纯度的HpaA重组蛋白，该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，可用于研制幽门螺杆菌疫苗。

1份正反定型不符献血者标本的血清学及分子特性分析497-499

摘要：目的对1份正反定型不符的献血者标本进行血清学及分子特性分析。方法采用吸收放散试验进行红细胞弱抗原检测，SSP-PCR方法进行基因分型，PCR产物克隆后进行测序分析。结果该标本血清学反应格局符合Ax亚型，分子生物学检测为A型。测序结果表明，Exon4含有2个连续碱基错义突变位点，分别为nt187G〉A，nt188C〉T，导致第63位氨基酸的改变（Arg63His）。结论该Ax亚型是由于Exon42个碱基突变，引起氨基酸的改变，导致糖基转移酶活性的降低，从而使红细胞上表达的A抗原大大减少。

中国生物制品学杂志预防制品

水泡性口炎病毒保护性抗原基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性500-503

摘要：目的构建水泡性口炎病毒（VSV）保护性抗原基因的重组核酸疫苗质粒，并检测其免疫原性。方法利用RT-PCR从VSV中扩增G蛋白基因，构建重组表达质粒pIRES-G1500，转染BHK-21细胞，以间接免疫荧光、PCR、SDS-PAGE、ELISA和Western blot检测质粒的表达，用核酸疫苗质粒免疫BALB／c小鼠，检小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。结果构建的重组核酸疫苗质粒在BHK-21细胞中获得正确表达，质粒免疫小鼠后，可刺激脾细胞、T淋巴细胞亚类数量及CTL杀伤活性显著升高，并可产生高滴度的抗VSV特异性抗体。结论该重组核酸疫苗质粒可作为VSV的候选疫苗。

中国生物制品学杂志治疗制品

小鼠神经生长因子基因治疗型DNA质粒的质量控制504-509

摘要：目的对小鼠神经生长因子（NGF）基因治疗型DNA质粒进行质量控制。方法用酶切鉴定法和PCR法进行DNA质粒的结构确认，鸡胚背根神经节法和免疫印迹测定DNA质粒表达产物的生物学活性，分光光度法测定浓度，琼脂糖凝胶电泳法和DNA-NPR-HPLC法测定纯度，气相色谱法测定乙醇和异丙醇残留量，琼脂糖凝胶电泳法测定RNA残留量，其余检测项目按《中国药典》三部（2005版）规定进行。结果用上述方法对原液和成品进行了检定，各项指标均符合《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》和《中国药典》三部（2005版）的要求。结论所采用的质控方法和质量标准能够保证该DNA质粒的安全、有效，可用于治疗型DNA质粒的质控。