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中国生物制品学 2008年第03期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达169-173

摘要：目的构建二硫键稳定的抗HIV-1gp41单链抗体（dsFv）基因原核表达载体，并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法，构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41，BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，定向插入pET-28a（＋），转化大肠杆菌BE21（DE3），IPTG诱导表达，用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性，并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定，证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000，与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45．48％。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后，蛋白纯度达95％以上，抗HIV-1gp41 dsFv具有抗原结合活性，稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1gp41单链抗体（dsFv）基因原核表达载体，并获得表达，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体的构建178-184

摘要：目的构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达目的蛋白。方法合成人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位的串联基因，克隆入pET-28a（＋）载体中，构建重组表达载体pET-28a-H3，经酶切鉴定和DNA序列分析后，转化大肠杆菌BL21（DE3），IFTG诱导表达，并进行EIISA和Western blot鉴定。结果重组载体pET-28a-H3酶切片段大小和DNA序列分析与预期结果一致。表达的目的蛋白相对分子质量约9400，与相应的多克隆抗体反应性良好。结论已成功构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体pET-28a-H3，并表达了目的蛋白，为制备单克隆和多克隆抗体奠定了基础。

抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定185-189

摘要：目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Ceempin D，并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性，人工合成6条寡聚核苷酸片段，经磷酸化、退火、连接并克隆人酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115，经G418筛选，阳性高拷贝克隆用0．5％的甲醇诱导表达，表达产物经CM—Sepharose层析柱纯化，Tricine-sDS．PAGE分析，琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测，在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带，纯化后的目的蛋白纯度达90％以上，获得的抗菌肽Ceeropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Ceeropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达，为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。

核心蛋白聚糖在毕赤酵母中的表达及活性检测190-193

摘要：目的利用巴氏毕赤酵母真核表达系统表达人核心蛋白聚糖DCN，并检测其抗肿瘤活性。方法利用DCN的特异引物，通过RT-PCR扩增人DCN基因，与载体pPIC9K连接，将序列正确的重组体扩增后，酶切线性化，通过醋酸锂法转化酵母菌HIS／GS115，G418筛选阳性克隆，用含1％甲醇的BMMY培养基诱导表达，并观察纯化的表达产物对人肝母细胞瘤细胞（HepG2）增殖的影响。结果表达产物作用于HepG2细胞后，与对照组相比，细胞增殖数量及速度均显著降低。随着表达产物浓度的升高及作用时间的延长，抑制作用也增强，并表现出浓度和时间依赖性关系。细胞形态学观察表明DCN对HepG2生长有明显抑制作用。结论已成功构建了pPIC9K-DCN真核表达载体，并表达了有活性的蛋白产物。

天花粉蛋白的定点突变及聚乙二醇修饰194-196

摘要：目的对天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS）进行定点突变及聚乙二醇（PEG）修饰，并对修饰产物进行DNA酶活性分析。方法选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点（YFF81．83和KR173-174）进行定点突变，将所构建的两个突变体（TCSYFF81-83ACS和TCSKR173-174CG）在大肠杆菌中表达，并纯化表达产物。通过第82位和173位引入的半胱氨酸残基，分别对突变体蛋白进行PEG定点修饰。通过与突变型TCS比较，分析两个PEG修饰型TCS的DNA酶活性。结果突变的TCS经酶切鉴定及测序分析，证明质粒构建正确，表达的目的蛋白相对分子质量约为30000，经PEG修饰后，相对分子质量约为40000。初步分析显示，与突变型TCS相比，所构建的两个PEG修饰型TCS也显示出类似DNA酶活性。结论成功进行了TCS的定点突变及PEG修饰，为基因工程及化学修饰方法改造TCS提供了一条可行的途径。

三七皂苷R1对铝佐剂甲型肝炎疫苗的免疫增强作用197-200

摘要：目的探索三七皂苷R1对Al（OH）3佐剂甲型肝炎疫苗的免疫增强作用及降低铝佐剂用量的可行性。方法在甲型肝炎病毒（HAV）抗原中，加入不同剂量的铝佐剂与三七皂苷R1构成复合佐剂，经肌肉注射免疫小鼠，每隔4周检测小鼠血清HAV-IgG水平，并与无佐剂组和单独铝佐剂组进行比较。结果各免疫组抗体水平在12周时达到最高，之后逐渐下降。在抗原中加入复合佐剂后，与无佐剂组相比，IgG水平显著升高；与单独铝佐剂组相比，加入一定剂量的三七皂苷R1能够显著增强铝佐剂的作用，且抗体水平维持时间较长。结论适当剂量的铝佐剂与三七皂苷R1混合作为佐剂，具有增强铝佐剂的作用，并能降低铝佐剂的用量。

C型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性201-203

摘要：目的研究C型产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因重组工程菌BL21（DE3）／pXETAB2B1抗原的免疫原性。方法在对重组工程菌BL21（DE3）／pXETAB2B1进行优化表达的基础上，制备包涵体粗提物、全细胞培养物及全细胞乳糖诱导培养物3种抗原，对ICR小鼠进行攻毒保护试验。结果重组工程菌BL21（DE3）／pXETAB2B1能够表达α-β2-β1融合蛋白，该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体，达到保护的目的。结论已获得具有一定免疫原性的重组工程菌，可作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。

柯萨奇病毒B4对ICR小鼠胰腺组织及糖耐量的影响204-206

摘要：目的研究柯萨奇病毒B4（CVIM／jlu06株）对ICR小鼠胰腺组织及糖耐量的影响，探讨柯萨奇病毒感染与Ⅰ型糖尿病（T1D）之间的关系。方法CVB4／jlu06毒株腹腔注射感染ICR小鼠，感染后不同时间取小鼠胰腺组织，进行病理及免疫组化分析，并测定糖耐量。结果随着感染时间延长，小鼠胰腺组织损害加重。免疫组化染色在胰腺组织中检测到大量病毒抗原。感染后117d，病毒感染小鼠糖耐量水平比未感染对照组明显降低，且差异有显著意义。结论CVV4／jlu06毒株感染可引起ICR小鼠糖尿病样症状，其感染可能与T1D的发生密切相关。

中国生物制品学杂志预防制品

多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达207-211

摘要：目的通过构建多拷贝数表达质粒，获得高表达乙型肝炎表面抗原（HBsAs）的毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造，将表达盒（5’AOX-HBsAg-TT）重复导入载体，构建多拷贝数表达质粒。通过电转化、15L规模发酵和纯化，获得纯化HBsAg颗粒，并对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行分析。结果多拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot检测，显示出良好的特异性，电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒（VLP），其表达量与拷贝数呈正相关，拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响，HBsAg制备的免疫原能有效刺激小鼠产生保护性抗体。结论含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。

中国生物制品学杂志消息

征稿211-211

中国生物制品学杂志预防制品

禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗的制备212-215

摘要：目的制备禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗，并优化其制备工艺。方法采用逆向蒸发法制备禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗，通过正交试验进行制备条件的优化，用荧光法测定脂质体的包封率。筛选制备高包封率脂质体核酸疫苗的最佳条件，测定脂质体粒径，并对疫苗免疫效果进行检测。结果制备高包封率的禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗的工艺为：卵磷脂、胆固醇的比例为2：1（摩尔比），转速为150r／min，温度为45℃，包封率可达80．31％。脂质体粒径平均为149啪，脂质体核酸疫苗显著提高了疫苗的免疫效果。结论按本工艺制备的禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗包封率高，脂质体粒径均一，免疫效果良好。

中国生物制品学杂志消息

《生物技术药物研究开发和质量控制》（第2版）征订启事215-215

中国生物制品学杂志治疗制品

小鼠NGF基因治疗型DNA质粒的构建及中试工艺的优化216-220

摘要：目的构建小鼠NGF基因治疗型DNA质粒，并进行中试工艺的优化。方法用SignaIP 3．0 Server软件选择并设计与NGF融合的信号肽；根据哺乳动物密码子偏爱性，对小鼠NGF的编码序列进行优化；通过流加补料等方式优化中试生产工艺；体外瞬时转染测定DNA质粒的表达和体外生物学活性。结果所构建的含有IgG／ngf的重组质粒，通过中试规模的发酵和纯化，获得了大量的高纯度重组质粒，该重组质粒可以在体外表达出具有生物学活性的NGF。结论构建了具有与小鼠NGF相似的生物学活性的重组质粒，并建立了中试生产工艺。

小鼠骨髓间充质干细胞对异基因肝移植模型大鼠移植区域组织损伤的修复作用221-223

摘要：目的观察小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）注入后在异基因肝移植模型大鼠移植区域的迁徙、定居及组织修复作用，探讨MSCs诱导异基因移植免疫耐受的可能性。方法将昆明小鼠肝组织块埋入Wister大鼠肝脏切口，制备异基因肝移植大鼠模型；体外分离、纯化并培养昆明小鼠乳鼠MSCs；经DAPI标记后，尾静脉注入模型大鼠，通过激光共聚焦显微镜，分别在24h、5d及10d观察MSCs在肝脏移植区域的迁徙及定居；采用HE染色观察肝移植区域组织损伤情况。结果MSCs尾静脉注入后，24h即出现在肝移植区域，5d时分布于血管周围，10d时扩散至移植区域血管及周围组织；MSCs治疗5d，HE染色显示移植区域浸润的炎性细胞减少，可见肝组织结构。结论小鼠MSCs可在大鼠体内存活，并参与损伤区血管及组织的修复。

慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠神经细胞Caspase-3表达及GDNF给药的影响224-226

摘要：目的观察慢性脑缺血后致认知功能障碍大鼠神经细胞半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）表达，并探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对大鼠认知功能障碍和Caspase-3表达的影响。方法采用双侧颈总动脉永久结扎方法制备慢性前脑缺血大鼠模型，随机分为对照组、GDNF组和生理盐水组，分别在术后1月、2月，根据逃避潜伏期对各组大鼠进行记忆功能测定，应用免疫组织化学方法检测Caspase-3表达。结果双侧颈总动脉结扎1、2月组与对照组相比，逃避潜伏期明显延长；GDNF组与生理盐水组比较，逃避潜伏期明显缩短；与对照组相比，缺血组大鼠额叶皮层、海马的Caspase-3阳性细胞数明显增多，与生理盐水组比较，1、2月GDNF组大鼠额叶皮层、海马的Caspase-3阳性细胞数明显减少。结论GDNF可改善认知功能，其机制可能是通过影响Caspase-3凋亡关键蛋白酶表达，抑制神经细胞凋亡。

中国生物制品学杂志诊断制品

促凋亡蛋白BID多克隆抗体的制备与鉴定227-230

摘要：目的制备抗BID的多克隆抗体，用于检测凋亡信号转导过程中BID蛋白的表达。方法采用PCR技术合成编码BID特异性肽段的基因，构建GSF融合基因表达载体，在E．coli BL21中诱导表达GST-BID多肽的融合蛋白，经Glutathione Sepharose 4B纯化后免疫家兔，免疫血清经纯化后，得到抗BID的多克隆抗体，经Western blot鉴定其特异性。结果通过PCR扩增获得了BID肽段的编码基因；pGEX-6P-1-BID多肽重组质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确；在E．coliBL21中表达了GSr-BID多肽融合蛋白；纯化后蛋白纯度达95％；制备的抗BID多克隆抗体能够特异地识别BID蛋白。结论所制备的抗BID多克隆抗体可特异性检测BID蛋白。

巨细胞病毒感染PCR检测方法的建立231-234

摘要：目的建立检测巨细胞病毒污染的PCR检测方法，并制备检测试剂盒。方法采用TaqMan探针，选择保守序列CMV-pp65设计引物，荧光定量病毒载量；对试剂盒进行敏感性、重复性和特异性等测试；对31份临床阳性血清标本和106份正常献血者血浆标本进行检测，并与国内同类试剂盒进行比较。结果该试剂盒检测线性定量范围可达202～3．6×10^9copies／ml，敏感性为360copies／ml，CV值在1％左右，特异性高，临床标本检测的符合率为100％。本试剂盒与国内已上市试剂盒比较，具有较好的相关性、更高的敏感性和更宽的定量检测范围。结论制备的试剂盒特异性和敏感性均较高，适用于临床上的病毒检测。

中国生物制品学杂志临床观察

黑龙江省肇东县1986和2005年乙型肝炎流行状况比较分析234-234

摘要：2004～2006年，我中心与国家疾病控制中心病毒所合作，在肇东现场开展了型乙肝炎流行模式的研究，对1986年曾经筛查过的人群以家庭为单位，进行一次横断面调查，调查结果与原本底资料进行比较分析，现将结果报道如下。