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中国生物制品学 2008年第01期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

丙型肝炎病毒NS5B全长基因及截短形式基因的克隆、表达及鉴定1-4

摘要：目的构建丙型肝炎病毒（HCV）NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体，并进行目的蛋白的表达及鉴定。方法利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因，经BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-28a（＋）上，转化大肠杆菌B121（DE3），IPIG诱导表达重组蛋白，并进行纯化及鉴定。结果所构建的3种重组质粒pET-28a（＋）-NS5B-FL、pET-28a（＋）-NS5B-C21和pET-28a（＋）-NS5B-C51，转化大肠杆菌B121（DE3）后，经PCR及酶切鉴定，均能扩增或酶切出相应大小的目的基因片段，表达的6His-NS5B-FL融合蛋白主要以包涵体形式存在，而表达的6His-NS5B-C21和6His-NS5B-C51融合蛋白的可溶性明显增加。纯化的6His-NS5B-C21蛋白未发生降解，6His-NS5B-FL和6His-NS5B-C51蛋白发生了部分降解。纯化后的3种蛋白均能与丙肝患者血清发生反应。结论已成功构建了3种NS5B基因的重组表达载体，并获得了目的蛋白表达，为进一步抗HCV药物的筛选奠定基础。

携带人白细胞介素-1受体拮抗剂基因腺病毒质粒的构建5-7

摘要：目的构建携带人白细胞介素-1受体拮抗剂（hIL-1Ra）基因重组腺病毒质粒。方法用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切质粒pcDNA3-hIL-1Ra，获得hIL-1Ra cDN段，并定向连接在pShuttle-CMV穿梭载体上，构建穿梭质粒pShuttle-CMV／h IL-IRa。经PmeⅠ酶切线性化，穿梭质粒pShuttle-CMV／hIL-1Ra与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，二质粒在细菌内同源重组，得到重组pAd／hXL-1Ra腺病毒质粒。脂质体介导pAd／hIL-1Ra质粒转染HEK293细胞，包装产生复制缺陷型重组腺病毒，经反复感染HEK293细胞扩增病毒后，氯化铯密度梯度离心法纯化病毒，并测定病毒颗粒数、纯度及滴度。结果经PCR鉴定、限制性酶切分析及序列测定，证明已正确构建重组pShuttle-CMV／hIL-1Ra穿梭质粒和重组pAd／hIL-1Ra腺病毒质粒。扩增纯化后，重组腺病毒颗粒数为1．19×10^11OPU／ml，A260／A280为1．279，滴度为3．6×10^9CCID50／ml。结论已成功构建重组腺病毒质粒pAd／hIL-1Ra，为hIL-1Ra基因在腺病毒载体介导下的免疫抑制治疗研究奠定实验基础。

牛磺酸对新生大鼠心肌成纤维细胞一氧化氮系统的影响8-11

摘要：目的观察牛磺酸（Taurine，Tau）在血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）诱导新生大鼠心肌成纤维细胞（Cardiac fibroblast，CFb）增殖的过程中对诱导型一氧化氮合酶-一氧化氮（iNOS-NO）系统的影响，以揭示Tau抑制CFb增殖的初步机制。方法胰酶消化法分离培养新生大鼠CFb，用AngⅡ诱导促进其增殖，采用MTT法检测细胞增殖；羟脯氨酸试剂盒检测胶原含量；ELISA法测定转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白的含量；流式细胞仪检测细胞周期；硝酸还原酶法、分光光度法和免疫荧光法检测CFb NO含量、一氧化氮合酶（iNOS）活性和iNOS蛋白的表达。结果Tau（40、80和160mmol／L）可抑制AngⅡ诱导的CFb增殖、胶原合成增加及TGF-β1蛋白含量增多，同时使细胞G0／G1期百分率增加，S期细胞百分率降低，并明显提高CFb NO含量、iNOS的活性及iNOS蛋白的表达量，且呈现剂量依赖性。结论牛磺酸通过提高CFb iNOS-NO系统的活性，拮抗AngⅡ的部分生物效应，致使CFb的增殖和胶原合成受到抑制。

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中国生物制品学杂志基础研究

百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性片段的筛选、克隆与表达12-15

摘要：目的筛选百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性的片段，并对其进行克隆及表达。方法采用生物信息学软件对丝状血凝素分子的结构进行预测，从中筛选出具有强免疫原性的片段FHAs。经PCR扩增，T-A克隆后，构建表达质粒pET-22b（＋）-FHAs，酶切鉴定正确后测序。将测序正确的质粒转化E．coli BL21（DE3），IPTG诱导目的蛋白的表达，并对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE分析及Western blot鉴定。结果从丝状血凝素分子中筛选出具有138个氨基酸的肽段FHAs，经PCR扩增，得到约400bp的目的基因片段，构建的重组质粒经双酶切和测序鉴定，证明质粒构建正确，重组工程菌pET-22b（＋）-FHAs/BL21经IPIG诱导，目的蛋白的表达量在50％以上，主要以包涵体形式存在。Western blot分析证实该蛋白能与抗FHA单抗发生反应。结论筛选出的肽段FHAs具有强的免疫原性和免疫反应特异性，为百日咳基因工程疫苗的研究奠定了基础。

2007年吉林省散发野型麻疹病毒H基因序列分析16-18

摘要：目的分析2007年吉林省散发野型麻疹病毒的基因型别和特征。方法对2007年吉林省分离到的3株散发麻疹野型病毒，经RT-PCR扩增血凝素（H）基因片段，克隆到pMD19-T载体，进行酶切鉴定及序列测定，并分析核苷酸序列，与GenBank中麻疹病毒的22个代表株H基因序列的同源性进行比较。结果RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，可见大小约为570bp的片段，克隆至pMD19-T载体后，酶切鉴定结果与预期相符。3株麻疹病毒均属H1基因型，其H基因之间同源性为98．5％～99．6％，与其他已知麻疹病毒的22个基因代表株相比，在核苷酸水平上最大变异为9．7％。3株病毒与H1a参考株Chin93—2、H1b参考株Chin94-5和H1c参考株Chin94-7的平均遗传距离分别为0．007～0．015、0．013～0．021和0．015～0．023。结论H1a基因型毒株是导致吉林省2007年春季麻疹散发的优势毒株。

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征稿18-18

中国生物制品学杂志基础研究

甘油脱水酶α亚基基因的克隆、表达及纯化19-22

摘要：目的克隆甘油脱水酶α亚基基因，构建表达载体，表达并纯化融合蛋白。方法采用PCR技术克隆甘油脱水酶α亚基gldA基因，并将其重组到含组氨酸标签的表达质粒pET-32a（＋）中。将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化，并进行Western blot分析及活性检测。结果重组表达质粒pET／gldA经酶切鉴定及序列分析，证明构建正确。转化E.coli BL21（DE3）后，重组蛋白获得可溶性表达，融合蛋白相对分子质量约81000，与预期大小一致。经Western blot分析，纯化蛋白能与6-Histidine抗体产生特异性免疫反应。α亚基经检测，未显示活性。结论已成功获得甘油脱水酶α亚基蛋白，为进一步研究其生物学性能奠定了基础。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白功能性片段的原核表达及其免疫保护性23-25

摘要：目的 表达猪链球菌2型（SS2）溶菌酶释放蛋白（MRP）的功能性片段（tmrp），并检测其对小鼠的免疫保护性。方法将构建的重组克隆载体pMD-tmrp经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切，将切下的目的基因tmrp亚克隆至原核表达载体pGEX-3X中，转化E．coli BL21（DE3），鉴定正确后，用IPTG诱导，谷胱甘肽亲和层析纯化GST-tmrp，免疫BALB／c小鼠，测定其免疫保护率。结果阳性工程菌经IFFG诱导，表达了可溶性目的蛋白，相对分子质量约为73000。0．8mmol／L IPTG，37℃，pH7．2诱导4h，表达量最高，为25．36％。经亲和层析纯化，融合蛋白纯度达93．7％。免疫BALB／c小鼠后，免疫保护率可达60％。结论已成功获得了具有免疫活性的GST-tmrp。

马立克病潜伏期L-meq基因对CEF细胞p53 mRNA转录水平的影响26-29

摘要：目的研究鸡马立克病（MD）潜伏期L-meq基因对鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）p53 mRNA转录水平的影响，并探讨L-meq基因与端粒酶活性的关系。方法构建真核转染质粒pcDNA-L-meq，转染CEF细胞，采用实时荧光相对定量RT-PCR法检测MD潜伏期L-meq基因对CEF细胞p53 mRNA转录水平的影响，并用改进的TRAP法检测端粒酶活性。结果质粒pcDNA。L-meq经PCR及双酶切鉴定，均可见大小为1200bp的特异性片段。L-meq基因能激活CEF细胞中p53 mRNA的转录，在转染后48和72h，p53 mRNA的转录水平较相应的内参照升高，但在转染后72h，p53 mRNA转录水平降低，其RQ值由48h的0．15下降为72h的0．05。转染L-meq基因48和72h后，CEF细胞中端粒酶活性均比对照组稍微升高，但在48h的端粒酶活性比72h的稍高。结论鸡马立克病潜伏期L-meq基因能微弱地刺激端粒酶活性和p53 mRNA转录。

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本刊论文被评为“第五届中国科协期刊优秀学术论文”29-29

中国生物制品学杂志基础研究

大肠杆菌色氨酸操纵子基因的克隆与表达30-32

摘要：目的克隆并表达大肠杆菌色氨酸操纵子基因，提高其酶活性。方法利用PCR方法，从大肠杆菌31884基因组中直接克隆出色氨酸操纵子，并将其连接到原核表达载体pET-22b（＋）中，构建重组质粒pET-22b（＋）-Trp operon，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导重组蛋白表达，表达产物经SDS-PAGE分析，并测定酶活性。结果凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为7000bp，SDS-PAGE鉴定目的蛋白分别得到了表达，邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了2．7和3．2倍。结论已成功构建了重组表达质粒pET-22b（＋）-Trp operon，邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性在大肠杆菌中得到了提高，为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定了基础。

更正32-32

人前列腺癌PC-3细胞膜蛋白组学的分析33-35

摘要：目的分析人前列腺癌PC-3细胞中的所有膜蛋白，全面展示PC-3细胞中的蛋白质表达谱。方法采用一维SDS-PAGE，结合高效液相色谱-串联质谱的方法，分离并鉴定PC-3细胞中的膜蛋白。结果在严格的过滤参数条件下，PC-3细胞中鉴定出2172种蛋白，其中1499种经过基因本体评注（GOA）显示为已知细胞组分，其余为未知细胞组分。在已知细胞组分中，564种（37．6％）蛋白为质膜蛋白，其中138种为跨膜蛋白。跨膜蛋白中，21．17％被预测至少有1个跨膜区，57．66％有1-3个跨膜区，30．66％有4—9个跨膜区，11．66％有不少于10个跨膜区。许多新的蛋白也被鉴定，其中包括假设蛋白和一些cDNA序列。结论这些被鉴定蛋白的生物学功能和理化性质将有助于进一步理解前列腺癌侵袭和转移的分子机制，为寻找与前列腺癌转移相关的分子提供新的实验证据。

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中国生物制品学杂志预防制品

流感裂解疫苗纯化及裂解工艺的优化36-39

摘要：目的优化大规模生产的流感病毒裂解疫苗的纯化及裂解工艺。方法比较凝胶层析和蔗糖密度梯度超速离心的纯化效果，以及Triton X-100和去氧胆酸钠两种裂解剂在不同条件下的裂解效果。结果层析法纯度稍高于蔗糖密度梯度超速离心法，而蔗糖密度区带超速离心法的收率优于层析法。Triton X-100的裂解效果优于去氧胆酸钠，裂解剂浓度为0．5％或0．8％，裂解3或4h，裂解率达90％以上。疫苗在4℃保存1年后，所有检测项目均合格，4℃保存18个月和37℃保存28d后，HA含量仍保持在30μg／ml以上。结论已建立了切实可行的流感病毒裂解疫苗规模生产的纯化及裂解工艺。

冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗的稳定性40-41

摘要：目的 观察冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗在2—8℃保存的稳定性。方法将冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗放置在2-8℃条件下30个月，定期取样，观察其物理外观，进行鉴别试验，并测定多糖含量、分子大小、水分含量、异常毒性等质量控制指标，评价疫苗质量的稳定性。结果冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗于2—8℃ 30个月保存，各项质量控制指标仍符合该疫苗企业注册标准。结论冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗在2—8℃保存，其质量稳定。

中国生物制品学杂志治疗制品

伏立康唑PLGA纳米微粒的制备及其形态和释放特点分析42-44

摘要：目的制备伏立康唑PLGA纳米微粒，并分析其形态及释放特点。方法采用乳化-溶剂挥发法制备伏立康唑PLGA纳米微粒，用激光粒径分析仪及扫描电镜分别进行分散性和形态学分析，经HPLC分析其载药量及释放特点。结果经激光粒径分析，样品粒径峰值为（126±20）nm，分布指数为1．5。电镜观察颗粒分布均匀，表面光滑。HPLC分析载药量为（1．9±0．6）％，包封率约为12％，24h内存在突释，第2天到第8天缓慢释放。结论已成功制备了伏立康唑PLGA纳米微粒，能实现缓慢释放，减少给药次数的目的。