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中国生物制品学 2007年第04期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

逆转录病毒靶向介导HDV核酶体外抑制HBV表达233-236

摘要：目的包装携带HDV核酶的肝细胞靶向性逆转录病毒载体，并检测体外HDV核酶对乙型肝炎病毒表达的影响。方法采用脂质体法，分别包装出携带针对HBV不同基因组区域的HDV核酶的肝细胞靶向性重组逆转录病毒，感染HepG2215细胞，ELISA及荧光定量PCR检测HDV核酶对乙型肝炎病毒表达的抑制作用。结果pMSCV—U6-PreS2-Rz和pMSCV-U6-C-Rz对乙型肝炎病毒表面抗原抑制率明显高于其他HDV核酶和对照组，分别达80％和85％，且高于脂质体转染介导的同种核酶对乙型肝炎病毒表面抗原表达的抑制率。结论靶向性重组逆转录病毒能够携带HDV核酶进入HepG2215细胞，并且对乙型肝炎病毒的表达有较高的抑制作用，为抗病毒治疗的研究奠定了基础。

DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗的设计与表达237-239

摘要：目的利用塞姆利基森林病毒（SFV）复制子构建新型真核表达载体，并对含HIV-1中国流行株B亚型核心蛋白p24及多表位MEG嵌合基因的核酸疫苗进行表达与鉴定。方法将含SFV复制子的元件从pSFV-MCS中切下，连入含CMV启动子及增强子的pIRESneo载体中，构建新型真核表达载体pCS，再将含HIV-1 MEGp24基因插入至pCS载体中，构建重组核酸疫苗pCS-MEGp24。用脂质体法将重组质粒转染入BHK-21细胞，进行表达产物的检测。结果间接免疫荧光检测显示，重组质粒转染的BHK-21细胞能有效表达HIV-1 MEGp24，并与HIV阳性血清反应。结论所构建的核酸疫苗可在BHK-21细胞系内进行表达，且MEGp24基因的表达蛋白具有特异性，为构建新型HIV-1中国流行株核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。

人鼻病毒3C蛋白酶基因的克隆、表达、纯化及活性240-243

摘要：目的获得重组3C蛋白酶，开发一种新型的基因工程工具酶。方法通过RT-PCR方法获得人鼻病毒3C蛋白酶基因，克隆人表达载体pBV220，构建非融合表达载体pBV220-3C，转化大肠杆菌BL21（Gold）进行表达。表达产物经变性阳离子交换层析纯化后复性，再经Superdex-75凝胶过滤进一步纯化，获得的3C蛋白酶在4℃条件下，酶切融合蛋白IL-11，进行活性测定。结果3C蛋白酶在大肠杆菌中获得了稳定、高效表达，表达量约占菌体总蛋白的25％，以包涵体形式存在。经过纯化、复性，纯度达90％以上，获得的3C蛋白酶能够有效切割含3C酶切位点的融合蛋白。结论已成功开发了一种新型的基因工程工具酶。

草原兔尾鼠卵透明带3融合蛋白抗原的制备及免疫反应性244-247

摘要：目的大量制备重组的草原兔尾鼠卵透明带3（Recombinant Lagurus lagurus zona pellucida 3, r-LZP3 ）融合蛋白，并检测其免疫反应性。方法经密码子优化的Lzp3基因在E.coli BL21（DE3）中以包涵体形式表达融合蛋白，表达产物经洗涤、纯化、溶解、复性后，用Western blot、ELISA和抗生育试验鉴定免疫反应性。结果得到纯度达93％的r-LZP3蛋白。Western blot显示表达产物与LZP3小鼠抗血清出现特异性反应条带。ELISA表明免疫小鼠血清中LZP3抗体滴度达1：45000以上。抗生育试验表明r-LZP3蛋白免疫小鼠的避孕率为25％，平均每胎产仔数减少4-5只。结论已获得了大量具有显著免疫活性的r-LZP3蛋白，为控制草原兔尾鼠鼠害的研究提供了重要的抗原。

梅毒螺旋体特异抗原TP0684的克隆和表达248-251

摘要：目的克隆并表达梅毒螺旋体外膜蛋白TP0684，为研制早期诊断试剂盒提供依据。方法PCR法扩增TP0684编码基因。T-A克隆后构建表达质粒pET-22b（＋）．TP0684，经酶切鉴定后，转化E.coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达产物经Western blot鉴定。结果PCR法扩增出了1212bp的目的片段，原核表达质粒pET-22b（＋）-TP0684酶切鉴定正确，测序结果与GenBank上公布的该基因的CDS序列完全一致。转化E.coli BL21（DE3）后，IPTG诱导目的蛋白表达率为25％，SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约43000，Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论所表达的TP0684重组蛋白具有良好的免疫反应性，为进一步研究梅毒血清学诊断试剂奠定了基础。

结核分枝杆菌复活促进因子E的原核表达及纯化252-255

摘要：目的构建结核分枝杆菌复活促进因子E（RptE）的原核表达质粒，在大肠杆菌中表达并纯化。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfE基因，双内切酶消化后，与同样酶消化的pET32a（＋）载体连接，转化大肠杆菌Top10。阳性克隆经酶切和DNA测序鉴定正确后，将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导，由17启动子调控表达RpfE蛋白，并对表达蛋白进行鉴定和纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预期相符，测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，在相对分子质量41000处均可见特异性蛋白条带。经Ni^2＋ -NTA金属螯合层析后，重组蛋白纯度可达90％以上。结论已成功地克隆并构建了RpfE基因的重组表达质粒pET32a（＋）-RpfEv，并获得了高纯度的重组蛋白，为以后的深入研究奠定了基础。

PCNA与AgNOR检测在诊断子宫内膜病变中的应用256-259

摘要：目的探讨增殖细胞核抗原（PCNA）与核仁组成区嗜银蛋白（AgNOR）在子宫内膜样腺癌早期诊断与预后中的作用。方法采用免疫组化SP法及银染法，检测132份不同子宫内膜组织中PCNA的增殖指数与AgNOR颗粒数，并分析其与各临床病理指标的相关性以及二者之间的联系。结果PCNA增殖指数与AgNOR颗粒数在正常子宫内膜（16％，2．51±1．97）、子宫内膜增殖症（40％．2．92±2．02）、子宫内膜非典型增生（63．16％．3．04±2．05）、子宫内膜样腺癌组织（74．60％，7．43±2．18）中依次呈升高趋势；且在子宫内膜样腺癌组织中，PCNA增殖指数显著高于子宫内膜增殖症及正常子宫内膜组织，AgNOR颗粒数显著高于良性病变组及正常子宫内膜，形态由单一型向弥散型转变。在子宫内膜样腺癌组织中，随着临床分期的进展、细胞分化程度的降低和淋巴结的转移，PCNA增殖指数与AgNOR颗粒数逐渐增高，差异有显著意义。在不同子宫内膜组织中，PCNA增殖指数与AgNOR颗粒数呈正相关。结论PCNA增殖指数和AgNOR颗粒数与子宫内膜样腺癌的发生、发展密切相关。联合检测PCNA与AgNOR的定量值对早期诊断子宫内膜样腺癌、判断疾病预后有一定的临床价值。

中国生物制品学杂志实验技术

重组人促红细胞生成素的HPLC与UPLC肽图谱分析259-259

摘要：重组人促红细胞生成素（rHuEPO）是一种糖蛋白，相对分子质量约为30000，目前多用于治疗贫血。其活性主要由蛋白部分决定，因此反映EPO一级结构的肽谱图通常是控制制品质量的重要标准。目前《中国药典》三部（2005年版）规定的方法是在特定条件下，以胰蛋白酶水解rHuEPO，用HPLC分离酶解后的肽段，与对照品进行对比，应保持一致。但HPLC分析rHuEPO酶解肽段存在分析时间较长和响应值相对较低的不足。

中国生物制品学杂志基础研究

人HSP70与MAGE-4表位基因原核表达载体的构建及表达260-263

摘要：目的构建热休克蛋白70（HSP70）与黑色素瘤抗原-4（MACE-4）抗原表位基因的原核表达载体，并对表达产物进行鉴定。方法在热应激条件下，用PCR法从结肠腺癌细胞获取HSP70基因。在线用蛋白质二级结构预测软件分析MAGE-4抗原表位，PCR获取MAGE-4抗原特征表位基因。将二者分别克隆入pGEM-T easy载体，酶切鉴定后，将HSP70基因亚克隆入pET28a原核表达载体，再将MAGE-4基因克隆入HSF70基因的下游，构建重组质粒pET28a-HSP70-MAGE-4。转化大肠杆菌，IPTG诱导表达并鉴定。结果所构建的HSP70与MAGE-4抗原表位基因表达载体pET28a-HSP70-MAGE-4，经PCR及DNA测序结果表明构建正确。SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带。结论已成功构建了人HSP70与MAGE-4抗原表位基因的原核表达载体，为疫苗研究提供了依据。

百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化264-266

摘要：目的克隆百日咳毒素S1亚单位，获得其突变体（S1／9K-129G，rS1），构建原核表达系统，并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体，将其与pMD18-T连接，转化至大肠杆菌DH5α，筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1，经双酶切得到rS1活性结构域编码片段。将其插入pQE-30载体中，转化大肠杆菌M15株，经IPTG诱导表达。表达产物经镍离子柱纯化，并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR及重叠延伸获得了约700bp的目的基因片段。并获得阳性重组表达载体克隆，表达产物为相对分子质量27000左右的蛋白，Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应。结论成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体，为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础。

C3d分子多表位DNA疫苗体液免疫应答的增强作用267-270

摘要：目的研究C3d分子对多表位DNA疫苗体液免疫应答的增强作用。方法通过PCR方法合成多表位HME基因，分别插入真核表达载体pcDNA3．1和pcDNA3．1-3C3d，构建多表位DNA疫苗pcDNA3．1-HME和pcDNA3．1-HME-3C3d，经肌肉注射免疫小鼠，ELISA检测小鼠特异性抗体水平。结果经免疫的小鼠均能产生针对各表位的特异性IgG抗体，且pcDNA3.1-HME-3 C3d免疫组小鼠的抗体水平明显高于pcDNA3．1-HME免疫组。结论C3d可增强多表位DNA疫苗的体液免疫应答水平。

SPF金黄仓鼠原代肾细胞的安全性271-272

摘要：目的验证SPF金黄仓鼠原代肾细胞的安全性。方法采用ELISA法检测10种鼠源病毒血清抗体。通过细胞直接观察、细胞培养试验和血吸附病毒试验检测外源因子。并用直接XC蚀斑法、S＋L检验法、电镜观察和双模板法以及联合培养与F-PERT法检测逆转录病毒及逆转录酶活1生。结果10种鼠源病毒抗体为阴性，未检出外源因子、逆转录病毒和逆转录酶。结论SPF金黄仓鼠原代肾细胞作为乙型脑炎减毒活疫苗的生物原材料安全可靠。

中国生物制品学杂志预防制品

A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗的研制273-275

摘要：目的研制A、C、W135、Y群脑膜炎球菌四价多糖疫苗，并采用新方法去除细菌内毒素。方法经细菌培养后，分别提取A、C、W135和Y群脑膜炎球菌荚膜多糖，纯化后，采用超速离心和层析技术相结合去除内毒素，按一定的配比制成四价多糖原液，加入保护剂，制成冻干疫苗，并进行检定。结果所研制的A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗各项指标均达到了质控标准，内毒素含量小于10EU／μg，具有良好的安全性及有效性。结论已成功制备了A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗。

人用冻干无佐剂狂犬病疫苗的临床观察276-277

摘要：目的观察人用冻干无佐剂狂犬病疫苗（武生欣宁）接种人体后的临床反应和免疫效果。方法40名健康者分别于0、3、7、14和28d接种疫苗，观察接种者副反应，并于接种后采血，用快速荧光灶抑制试验检测血清中和抗体水平。结果第1针和第2针接种后副反应率分别为2．5％和7．9％，后3针副反应率为0。免疫前抗体均为阴性，接种后第7天抗体阳转率为76％，第14天抗体水平GMT为9．42IU／ml，阳转率100％，第28天抗体水平GMT为9．83IU／ml，阳转率100％。结论人用冻干无佐剂狂犬病疫苗反应轻微，效果良好。

18C型肺炎球菌荚膜多糖的水解及水解片段的特性278-281

摘要：目的探索不同乙酸水解条件对18C型肺炎球菌多糖的水解效果。方法选择60℃和92℃2种温度，以不同乙酸浓度和不同时间对多糖进行水解，用层析法检测相对分子质量，免疫双扩散法和ELISA抑制法分别检测活性。结果0．2mol／L乙酸92℃水解16h，水解程度趋于稳定，相对分子质量可达57000；1．0mol／L乙酸60℃水解40h，水解程度趋于稳定，相对分子质量可达235000；用1．0mol／L乙酸在不同温度下水解时，随着温度升高，水解程度增加，而在92℃不同乙酸浓度对水解程度几乎无影响。上述条件所得水解片段均保留了抗原性，但随着相对分子质量的降低，抗原性有所减弱。结论在不同条件下，乙酸能将18C型肺炎球菌荚膜多糖水解为不同大小的片段，且未破坏抗原决定簇的基本结构。

中国生物制品学杂志治疗制品

重组人骨形态发生蛋白-7复合体对牙槽骨再生的影响282-284

摘要：目的观察基因重组人骨形态发生蛋白-7（rhBMP-7）与明胶海绵的复合体对犬牙槽骨再生的影响。方法犬拔牙刨内植入rhBMP-7与明胶海绵的复合体，以自然愈合拔牙创为对照。于术后2、4、8周分别将犬处死，取拔牙创处牙槽骨标本，行X线和组织学切片检查，观察成骨情况及牙槽骨萎缩情况。结果X线及组织学切片显示实验侧成骨速度及成骨质量明显优于对照侧。结论rhBMP-7与明胶海绵复合体是一种可促进牙槽骨再生的新型生物复合材料。

第三次全国现代免疫诊断与疫苗学术研讨会征文通知284-284

阿尔采默病治疗性疫苗原核表达载体的构建285-286

摘要：目的构建阿尔采默病治疗性疫苗原核表达载体。方法选择Aβ42的B细胞优势表位的15个氨基酸基因序列，与趋化因子BCA-1基因连接，克隆至经突变改造的原核表达质粒pRSET／no His中，经酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切鉴定及DNA测序确定已将BCA-1／A β1-15克隆到表达载体pRSET／no His中。结论已成功地构建了Aβ42亚单位疫苗的原核表达质粒。