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中国生物制品学 2007年第02期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

新城疫强毒株F蛋白裂解位点串联基因的构建及其原核表达73-76

摘要：目的构建鸡新城疫（ND）强毒株多裂解位点串联基因表达载体，为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法奠定基础。方法人工合成一段包含4种不同NDV强毒株裂解位点的基因Fe（F protein multitude epi-position）。其中各裂解位点之间用Linker（GGGGS）使其串联，然后进行2倍和4倍拷贝，并定向克隆至原核表达质粒pET-28a（＋）中，构建重组表达质粒pET-28a（＋）／2Fe和pET-28a（＋）／4Fe，进行表达和Western blot鉴定。结果构建的原核表达重组质粒pET-28a（＋）／2Fe和pET-28a（＋）／4Fe测序正确。Western blot检测结果表明，2Fe、4Fe蛋白均与新城疫强毒株F48E9阳性血清呈阳性反应。而与新城疫弱毒株V4阳性血清呈阴性反应。结论已成功构建NDV强毒株F蛋白裂解位点串联基因表达载体，为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法提供理论依据。

重组人成熟型转化生长因子β1及其抗原表位在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫原性鉴定77-80

摘要：目的研制人转化生长因子（TGF）-β1自体蛋白疫苗，并诱导小鼠产生抗人TGF-β1的中和抗体。方法将hTGF-β1及其抗原表位基因β32：和β80分别克隆入pGEX-4T-1原核表达载体，并引入T细胞辅助表位（TT），转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达。应用GST亲和层析纯化重组融合蛋白，并经Western blot鉴定，用流式细胞术（FCM）检测抗hTGF-β1抗血清与人肝癌细胞株SMMC-7721表面膜型TGF-β1的结合状况。用纯化蛋白免疫BALB／c小鼠，通过ELISA检测血清中抗hTGF-β1抗体的效价。结果成功构建了人成熟型TGF-β1及其不同表位基因片段的重组表达质粒pgEX-Tr-β32、pGEX-Tr-β20和pGEX-β80．hTGF-β1，表达的3种重组蛋白（GST-Tr-β32、GST-TT-β32和GST-TT-hTGF-β80）经Western blot鉴定显示，同时具有hT-GF-β1和GST的抗原性。经纯化后免疫BALB／c小鼠，血清抗人TGF-β1抗体的效价均达到1：10^4，其中GST-TT-β80的抗体效价最高。FCM显示3种重组蛋白免疫的小鼠抗血清均能与高表达膜型TGF-β1的人SMMC-7721结合，但重组蛋白GST-TT-β80和GST-TT-hTGF-β1免疫组抗血清的结合率明显高于GST-TT-β32组。结论构建的人成熟型TGF-β1及其不同表位片段的不同融合蛋白疫苗均能够诱导BALB／c小鼠产生抗人TGF-β1的中和抗体。

白细胞介素-10基因多拷贝表达盒的构建及在毕赤酵母中的表达81-86

摘要：目的构建白细胞介素-10（IL-10）基因多拷贝表达盒，提高IL-10在毕赤酵母中的表达水平。方法体外构建重组表达载体αIL-10／pA0815，BamHⅠ和BglⅡ双酶切获得目的基因表达盒（AOX-αIL-10），再连接到BglⅡ酶切位点处，依次构建多拷贝重组载体n（AOX-αIL-10）／pA0815。从质粒pPIC9K上用NdeⅠ和SalⅠ双酶切获得Kan抗性基因，重组到多拷贝表达载体n（AOX-αIL-10）／pA0815上。重组载体n（AOX-αIL-10）／pA0815电转化毕赤酵母，PCR筛选含有IL-10基因的酵母转化子，甲醇诱导表达，对表达量高的转化子再次经重组载体n（AOX-αIL-10）／pA0815-Kan电转化，高浓度G418抗性筛选二次酵母转化子，使用甲醇诱导表达。ELISA测定IL-10含量，MC／9细胞测定IL-10活性。结果所构建的8拷贝表达盒的重组载体8（AOX-αIL-10）／pA0815和4拷贝表达盒4（AOX-αIL-10）／pA0815-Kan，转化子分泌表达IL-10水平最高，为（8．25±1．65）mg／L，比活性为1．465×10^5U／mg。结论已成功构建了高拷贝表达盒，并提高了IL-10在毕赤酵母中的表达水平。

人源阳离子抗菌肽hCAP-18真核表达载体的构建与表达87-90

摘要：目的构建人源性阳离子抗菌肽hCAP-18的真核表达载体pcDNA4／Myc-His-hCAP-18，转染真核细胞，并检测其表达。方法以正常人外周血中性粒细胞的总RNA为模板，用RT-PCR技术钓取hCAP-18编码序列的全长eDNA，并克隆至pcDNA4／Myc—His真核表达载体上，转染真核细胞株HeLa。RT-PCR及Western blot方法检测目的基因的表达。结果所构建的真核表达载体pcDNA4／Myc—His—hCAP-18，经酶切鉴定所释放片段大小与预期相符，基因序列与GenBank上登录的序列一致，目的基因在转染细胞中获得高水平表达。结论已成功构建真核表达载体pcDNA4／Myc-His-hCAP-18，并在转染细胞中高效表达。

小鼠MUC1基因的克隆及其在大肠杆菌DH5α中的表达91-93

摘要：目的构建表达小鼠MUC1基因的工程菌，并纯化重组小鼠MUC1融合蛋白。方法通过RT-PCR扩增小鼠MUC1基因片段，连入pMAL—p2原核表达载体，并转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达，经Western blot鉴定，Amylose Resin亲和层析纯化。结果获得了小鼠MUC1 708 bp DN段，并构建了pMAL-mMUC1表达载体。表达产物相对分子质量约为67000，经Western blot鉴定，与兔抗MBP多克隆抗体产生特异性反应。纯化的融合蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带。结论成功构建了表达小鼠MUC1蛋白的工程菌。

pICln蛋白在不同细胞中的分布94-95

摘要：目的检测pICln蛋白在不同细胞中的分布。方法制备抗pICln蛋白的合成肽血清，并用Western blot对E1等细胞pICln蛋白的表达及猪和大鼠肾脏细胞中pICln蛋白的分布进行检测。结果E1等8种细胞均在相对分子质量约40000的位置出现免疫反应带。猪肾脏pICln主要分布在可溶性胞质中，大鼠肾脏pICln蛋白主要分布在不溶性的膜结构中。结论pICln蛋白在组织、细胞中普遍表达，为其实施某种功能作用奠定基础。

木瓜凝乳蛋白酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达96-97

摘要：目的构建木瓜凝乳蛋白酶（CP）的表达载体，并在大肠杆菌中表达。方法从生番木瓜中提取mRNA后进行反转录，得到木瓜凝乳蛋白酶的eDNA，PCR产物克隆到pET22-b（＋）载体中，重组质粒转化至大肠杆菌B121，进行诱导表达及表达产物的检测。结果表达产物的SDS-PAGE显示单一条带，相对分子质量约为26000。Western blot表明表达产物可与抗木瓜凝乳蛋白酶特异性抗体结合。结论CP基因已成功在大肠杆菌中克隆表达，为进一步纯化和动物实验奠定了基础。

基因工程菌株BLG8900的遗传稳定性98-99

摘要：目的研究基因工程菌株BLG900的遗传稳定性。方法在有选择压力（加氨苄西林）的条件下，测定pYC2质粒在大肠杆菌BLG8900株[含有质粒pYC2的B121（DE3）]中的遗传稳定性。结果工程菌连续传10、25、50和100代后质粒具有良好的稳定性，而且经BamHI／EcoRI双酶切，酶切图谱相同。第100代菌株重组质粒的GnRH／TRS序列与原代菌株相同。原代与第10、25、50和100代菌株经IPTG诱导表达，GST—GnRH／TRS融合蛋白表达水平、菌体蛋白的SDS-PAGE图谱鉴定无明显差异。Westem blot表明各代菌株表达产物均具有GnRH抗原特异性。结论质粒pYC2在大肠杆菌B121（DE3）宿主菌中有较好的遗传稳定性。

中国生物制品学杂志预防制品

脂质体流感疫苗的制备及免疫效果100-103

摘要：目的制备脂质体流感疫苗，并对其细胞免疫效果和小鼠保护效力进行检测。方法采用薄膜蒸发与冷冻干燥相结合的方法制得多层脂质体，与流感裂解疫苗按比例混合，制备脂质体流感疫苗。用该疫苗免疫BALB／c小鼠，MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖情况；流式细胞仪检测小鼠T淋巴细胞表面标记；EuSA法检测小鼠肺内容物中细胞因子含量；并检测小鼠的保护效力。结果在脾细胞增殖效率、CD4^＋水平、CD4^＋／CD8^＋比例以及细胞因子（IL-4、IFN-γ）水平上，实验组均有显著的增强作用，保护效力为4／6。结论脂质体流感疫苗能够刺激机体产生更强的细胞免疫应答和更高的保护效力。

重组HIV-1腺病毒载体活疫苗的冻干保护剂研究104-106

摘要：目的研制重组HIV-1腺病毒载体活疫苗的冻干保护剂。方法在重组HIV-1腺病毒载体活疫苗中加入不同配比的保护剂，在适宜条件下制备成冻干剂型。根据冻干后外观、病毒滴度和热稳定性试验等结果，筛选出冻干保护剂的最适配方。结果以人血白蛋白、海藻糖、甘露醇、右旋糖苷和蔗糖等成分按比例配伍制备的保护剂，对重组HIV-1腺病毒载体活疫苗显示了较好的保护作用。冻干前后疫苗病毒感染性滴度下降在0．17LogCCID50／ml以内；37℃放置1周，滴度下降0．3LogCCID50／ml左右；37℃放置3周后，滴度下降约为0．6LogcCID50／ml。而无保护剂的液体疫苗对照于37℃放置1周，滴度下降近2．5个LogCCID50／ml。结论以人血白蛋白、海藻糖、甘露醇、右旋糖苷和蔗糖等配伍而制备的保护剂效果较好。

人用狂犬病脂质体疫苗的免疫效果107-109

摘要：目的对狂犬病脂质体疫苗进行免疫效果评价。方法用狂犬病脂质体疫苗和无佐剂疫苗分别免疫小鼠，以NIH法检测保护效力，RFFIT法检测中和抗体，流式细胞仪检测淋巴细胞表面标记，体外实验法检测淋巴细胞增殖能力，乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞活性，ELISA检测试剂盒检测免疫后小鼠IL-2和IFN水平。结果狂犬病脂质体疫苗与无佐剂疫苗相比，可提高效力2—3倍，脂质体疫苗组中和抗体水平明显高于无佐剂疫苗组，两组之间差异有显著意义。狂犬病脂质体疫苗可增强细胞免疫，小鼠CD4^＋／CD8^＋比例、淋巴细胞增殖指数、NK细胞活性、IL-2及IFN活性与无佐剂疫苗相比，差异均有显著意义。结论狂犬病脂质体疫苗可同时增强细胞免疫和体液免疫。

中国生物制品学杂志治疗制品

治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究110-113

摘要：目的研究双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法首先通过计算质粒拷贝数，检测工程菌DH5α/pS2．S和DH5α/pFP在传代过程中的遗传稳定性，通过摇瓶培养确定培养基组成，再在30L发酵罐内，通过改变培养基成分、培养时间、补料方式，确定最佳发酵参数。并将确定的最佳发酵参数应用于50L发酵罐连续3批中试规模的发酵，同时考察在发酵培养过程中质粒稳定性和超螺旋质粒DNA的比例。结果工程菌DH5α/pS2．S和DH5α/pFP在连续传代30次后，质粒拷贝数保持稳定。确定最佳发酵参数为以甘油为碳源的培养基培养，梯度恒速流加方式补料，培养时间为10h。通过3批稳定发酵，最终可获得湿菌58．0～71．8g／L，质粒含量可达到1．11～1．58mg／g菌，超螺旋质粒DNA的比例达93％以上。结论已建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗工程菌中试发酵工艺，为进一步规模化生产奠定了基础。

腺苷对缺血再灌注后心肌的保护作用114-116

摘要：目的研究腺苷对大鼠心肌细胞凋亡及核因子KB（NF-κB）表达的影响。方法制备对照组（C组）、缺血再灌注损伤组（I／R组）和缺血再灌注前腺苷治疗组（AD组）的大鼠模型。电镜、光镜下观察心肌结构变化，采用原位缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡，免疫组织化学方法检测心肌组织NF-κB表达。结果AD组大鼠心肌细胞凋亡数（2645．0±326．0）及心肌组织中NF-κB的表达（32．21％±17．91％）明显低于I／R组（5113．0±503．7和60．30％±10．36％），明显高于对照组（67．7±51．3和11．98％±3．65％）。结论腺苷具有明显降低大鼠缺血再灌注后心肌细胞凋亡的作用，可能与腺苷减轻缺血再灌注心肌组织过度表达NF-κB有关。

干扰素壳聚糖／海藻酸钠微囊控释制剂载体的初步研究117-118

摘要：目的研究蛋白质类药物口服控释给药的可行性。方法壳聚糖与海藻酸钠通过聚电解质络合反应制备成壳聚糖/海藻酸钠微囊，以干扰素为模型药物，研究不同pH条件下，药物的控制释放情况。结果微囊的粒径为1mm左右，其干扰素的包封率达90．0％以上，微囊在模拟胃液（pH1．0）中，3h药物释放不到5％；在模拟肠液（pH7．4）中，3h药物释放近100％。结论壳聚糖／海藻酸钠微囊有可能成为蛋白质类药物口服控释制剂的载体。

中国生物制品学杂志诊断制品

布病胶体金免疫层析检测方法的建立119-121

摘要：目的建立诊断布病的胶体金免疫层析方法。方法以B.abortus544A全菌免疫BALB／c小鼠，以杂交瘤细胞技术制备单抗，纯化后以胶体金标记，选择最佳反应模式组装试纸条，并对其进行鉴定。结果已筛选488、1G9、1（29和1E24株稳定分泌单抗的细胞株，以其单抗互相配对组合的试纸条均能检出B.aborus544A菌。其中以1G9为包被抗体、488为金标抗体的试纸检测效果最佳，与以B.aborus 544A菌多抗为包被抗体、488单抗为金标抗体的试纸对比，检测结果一致，且不与其他菌发生交叉反应。对PCR检测为阳性的70份牛血清样品，两种试纸条检测结果的符合率均为100％。结论所建立的诊断布病的胶体金免疫层析法快速、简便、准确，有望用于布病的诊断。

中国生物制品学杂志实验技术

毛细管SDS无胶筛分电泳测定小分子多肽相对分子质量122-124

摘要：目的建立快速毛细管SDS无胶筛分电泳法（SDS—NGS），测定小分子多肽相对分子质量。方法涂层毛细管（管长30cm，内径100μm）；分离电压为9kV（300V／cm），分离温度为20℃；检测波长为214nm，检测时间为18min；所用SDS-多肽相对分子质量标准范围为2512—16949；以橙G（06）为内标参照物。结果在相对分子质量2512—16949范围内，多肽相对分子质量的对数与其相对迁移率具有良好的线性关系（r=0．996）；应用该方法测定了重组人奈西立肽、重组人表皮生长因子、虎纹镇痛肽、重组人心钠肽4种重组小分子多肽的相对分子质量，所测结果变异系数CV均小于3％。结论毛细管SDS无胶筛分电泳方便快速，灵敏度高，重现性好，结果准确，可作为小分子多肽相对分子质量的检测方法。

Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养125-128

摘要：目的探索Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养条件。方法在搅拌瓶中，选择合适的微载体，在无血清条件下培养Vero细胞和流感病毒。观察Vero细胞的生长状况，并检测流感病毒的血凝滴度。结果Vero细胞在Cytodex3上生长最好，每个微载体上接种10个细胞为最佳接种浓度，以MOI=0．005和0．010CCID50／细胞接种H1N1流感病毒后，在72h时，培养上清病毒血凝滴度达到最高。结论无血清条件下，Vero细胞在Cytodex3上生长良好，流感病毒能在Vero细胞上成功培养。

层析技术纯化核酸疫苗129-132

摘要：目的利用层析技术制备高纯度的核酸疫苗。方法用层析技术中的凝胶过滤、亲和、离子交换层析3种方法，依次对核酸疫苗进行纯化，并检测其纯度。结果连续使用3种层析方法获得的DNA达到了理想的分离效果，琼脂糖凝胶电泳未检出RNA，A260与A280的比值介于1．80～2．00之间，其中环状DNA达90％以上。经离子交换层析后的内毒素含量小于10EU／mg DNA，宿主DNA残留量小于0．002μg/μg DNA。结论纯化的核酸疫苗均符合国家标准，为制备核酸疫苗奠定了基础。