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中国生物制品学 2007年第01期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志基础研究

靶向高迁移率族蛋白A1基因RNA干扰真核表达载体的构建1-4

摘要：目的构建针对人高迁移率族蛋白A1（HMGA1）基因的RNA干扰真核表达载体，为研究HMGA1基因在肿瘤细胞中的作用奠定实验基础。方法设计合成特异性针对人HMGA1基因的寡核苷酸序列，梯度退火后，与pU6mRFP载体连接，构建重组载体，转染人肝癌细胞SMMC-7721。通过激光共聚焦显微镜观察红色荧光，估测转染效率，RT-PCR法检测转染细胞HMGA1 mRNA水平，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果DNA测序证实，成功构建了特异性HMGA1 siRNA真核表达载体，转染后72h，转染效率为40％左右。所构建的载体能够特异性沉默转染细胞HMGA1基因的表达。转染细胞HMGA1基因沉默后，细胞凋亡率（27．86％±2．44％）明显高于空载体对照组和SMMC-7721对照组（分别为2．82％±2．39％和2．04％±0．70％），G0-G1期细胞百分数（77．73％±1．78％）明显高于空载体对照组和SMMC-7721对照组（分别为42．19％±3．28％和39．23％±3．63％），G2-S期细胞百分数（22．27％±1．78％）明显低于空载体对照组和SMMC-7721对照组（分别为57．81％±3．28％和60．77％±3．63％）。结论成功构建了HMGA1的RNA干扰真核表达载体。

shRNA表达载体对耐阿霉素的人红白血病细胞株P-gp表达的抑制作用5-8

摘要：目的探讨靶向mdr1基因的shRNA表达载体对耐阿霉素的人红白血病细胞（K562／ADM）P-gp表达的抑制作用。方法合成靶向mdr1基因的短发夹shRNA表达载体，转染K562／ADM细胞。利用RT-PCR检测转染细胞中mdr1基因mRNA，Western blot、免疫细胞化学和流式细胞术分别检测P-gp的表达。结果在瞬时转染pSilencer^TM 3．1-H1 neo mdr1-A和mdr1-B shRNA表达载体的K562／ADM细胞中，mdr1基因mRNA转录分别减少到39．1％（P〈0．05）和30．8％（P〈0．01）。Western blot、免疫细胞化学和流式细胞术检测显示P-gp表达被明显而特异地抑制。结论靶向mdr1基因的shRNA表达载体能够特异而有效地抑制耐药的人红白血病细胞中的P-gp表达。

重组B7-H1IgV融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定9-14

摘要：目的以B7-H1为靶点，研制肿瘤免疫治疗蛋白疫苗。方法将人B7-H1胞外片段IgV区基因插入pQE-30原核表达载体，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达。Ni^2＋-NTA亲和层析纯化蛋白，Western blot鉴定。用纯化的rhB7-H1IgV蛋白免疫昆明小鼠，经ELISA、流式细胞术、免疫组化技术和CDC试验测定融合蛋白及其抗血清的生物学活性。结果所构建的pQE-30-Tr-B7-H1IgV表达载体，能稳定表达rhB7-H1IgV蛋白，经纯化后免疫昆明小鼠，可获得高滴度抗B7-H1抗血清。经流式细胞术和免疫组化检测显示，其抗血清可与HT-29／B7-H1^＋及SP2／0肿瘤细胞结合，且在CDC试验中，可依赖补体杀伤HT-29／B7-H1^＋及SP2／0肿瘤细胞。结论rhB7-H1IgV融合蛋白不仅可引发小鼠体液免疫应答，而且其抗体还能与表达B7-H1的肿瘤细胞相结合，并介导补体依赖的体外杀伤作用。

中国生物制品学杂志消息

《中国肿瘤生物治疗杂志》2007年度征订启事14-14

中国生物制品学杂志基础研究

外水相对胰岛素载药纳米颗粒胶体系统分散性的影响15-18

摘要：目的探索不同外水相组成对胰岛素纳米颗粒胶体系统分散性的影响，为深入开展纳米载药颗粒研究提供依据。方法采用高速高压联合均质机，经乳化-溶剂挥发法制备不同粒径的纳米载药颗粒，再通过光学显微镜、扫描电镜、激光粒径分析仪分析颗粒在胶体系统中的分散情况。结果高速均质和高速高压均质聚乙烯醇组粒径分布（d50）分别为（5．410±0．487）μm和（0．389±0．034）μm，高速均质和高速高压均质偏磷酸钠．柠檬酸盐缓冲液组粒径分布（d50）分别为（5．505±0．854）μm和（0．204±0．020）μm。联合均质结果缓冲液组粒径分布小于聚乙烯醇组，颗粒表面光滑平整；比表面积与之相反，聚乙烯醇组低于缓冲液组。结论偏磷酸钠-柠檬酸盐缓冲液作为乳化．溶剂挥发法制备胰岛素纳米载药颗粒的外水相，能够获得更好的分散体系。

乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在乳鼠脑内连续传代后病毒基因的变化19-21

摘要：目的研究乙型脑炎病毒（JEV）减毒株SA14-14-2的编码弱毒力基因变化与病毒毒力关系。方法乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在乳鼠脑内连续传代，检测各代病毒的生物学特性和病毒主要结构蛋白即E蛋白的基因序列，并与基因库中登录的JEW强毒株SA14和弱毒株的相应序列比较。结果JEV SA14-14-2在乳鼠脑内连续传代后，病毒的复制滴度增加，对小鼠的脑内毒力也有所增强，但仍低于其亲代强毒株SA14的水平。JEV SA14-14-2在乳鼠脑内传1代后，病毒E蛋白的基因序列未发生改变；传第2代时，E107位点氨基酸发生了变化；第3代开始，E138位点氨基酸出现了改变。其他个别位点氨基酸也发生变化，但无规律性。乙型脑炎病毒强弱毒株间发生变化的其余7个氨基酸未再发生改变。结论JEV SA14-14-2在乳鼠脑内传代过程中，E蛋白基因E107和E138位氨基酸是决定病毒毒力的关键氨基酸。其他非结构蛋白基因也可能与毒力有关。

人热休克蛋白70基因的克隆、表达及鉴定22-24

摘要：目的克隆人热休克蛋白70（HSP70）基因，构建其原核高效表达载体。方法将PCR扩增的HSP70基因克隆到原核高效表达载体pET-28b中，转化大肠杆菌JM109。挑选阳性克隆，提取质粒pE28b70F，转化大肠杆菌BL21（DE3）。IPTG诱导表达目标蛋白。结果在大肠杆菌中成功表达了HSP70，表达量约占细菌总蛋白的22．3％，其中可溶性目标蛋白占上清总蛋白的12％。Western blot表明该目标蛋白具有与鼠抗人HSP70单抗特异结合的抗原活性。通过Ni^2＋-NTA亲和柱，从1L诱导产物中纯化出约15～20mg重组蛋白，纯度在80％以上。结论已成功表达HSP70，为进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了基础。

表达HIV-1 Gag-Pol抗原的重组痘病毒的构建及免疫原性25-28

摘要：目的构建稳定高效表达HIV-1 Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体疫苗，并检测其体液免疫效果。方法将修饰型HIV-1 Gag-Pol基因插入到痘病毒表达载体pSC11m2启动子P7．5下游，经与野生型痘病毒同源重组后，进行蓝白斑筛选。用筛选得到的重组病毒rM-GP转染HEK293细胞，经SDS—PAGE和Western blot检测表达蛋白。用该重组病毒免疫BALB／c小鼠，并检测体液免疫应答。结果已筛选到稳定高效表达HIV-1 Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体rM-GP，经Western blot，在免疫小鼠血清中检测到抗HIV-1 p24蛋白的特异性抗体。结论重组痘病毒载体rM-GP能稳定高效表达HIV-1 Gag-Pol蛋白，并能引起有效的体液免疫应答。

艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区片段的表达及纯化29-32

摘要：目的表达并纯化艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区片段，为制备高效防治艰难梭菌感染的疫苗和诊断抗原奠定基础。方法提取艰难梭菌染色体基因组DNA，用PCR扩增ToxinB3基因，将其克隆至表达载体pET22b（＋）中，转化大肠杆菌BL21（DE3）。诱导表达产物经金属螯合层析纯化，用SDS—PAGE进行分析。结果已成功地克隆了艰难梭菌细胞毒素B羧基末端重复区域的1848bp的基因，经双酶切、PCR和测序鉴定，插入到载体的基因与GenBank中公布的艰难梭菌VPI10463 ToxinB3基因序列的同源性为99％。SDS-PAGE显示，目的基因表达产物的相对分子质量为71300，重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34％，可溶性表达占上清的14％，包涵体占沉淀的82．7％，纯化后可溶性蛋白浓度为0．781mg／ml。结论所构建的含艰难梭菌ToxinB3基因的pET22b（＋）CDB3重组质粒能高效表达目的基因。金属螯合层析纯化重组蛋白CDB3的方法简便．特异性好。

表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒对新生小鼠的被动免疫保护作用33-36

摘要：目的探讨表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒（Ad5／VP4）对新生小鼠的被动免疫保护作用。方法在293细胞上扩增表达猴轮状病毒SA11株VP4抗原的重组腺病毒并纯化。将轮状病毒抗体阴性的小鼠交配后的雌性小鼠，分别通过肌肉注射、滴鼻和口服免疫纯化后的重组腺病毒，生产后第7天和第8天，用轮状病毒SA11（1．0×10^6PFU）口服攻击乳鼠2次，观察出现腹泻症状的乳鼠的比例，并用ELISA检测母鼠的血清以及乳鼠胃囊乳块中的轮状病毒特异性抗体。同时以含有部分E1区基因的腺病毒5型载体（Ad5）作为对照。结果经3种不同途径免疫母鼠后，在血清和乳汁中均能检测到轮状病毒VP4特异性抗体。经滴鼻免疫的母鼠喂养的乳鼠，经攻击后保护率为100％（11／11）；经肌肉注射免疫的母鼠喂养的乳鼠，经攻击后保护率为30％（3／10）；经口服免疫的母鼠喂养的乳鼠，经轮状病毒攻击后保护率为80％（8／10）。对照组的小鼠全部出现了腹泻症状。结论表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒经滴鼻免疫母鼠后，能在乳汁中产生特异性的IgA和IgG抗体，并能保护新生小鼠对抗轮状病毒的攻击，保护率达100％。

中国生物制品学杂志消息

欢迎订阅《中国生物制品学杂志》36-36

中国生物制品学杂志基础研究

小鼠激活素受体相互作用蛋白5的基因克隆37-39

摘要：目的克隆新的小鼠激活素受体相互作用蛋白5（ActRIP5）基因。方法应用酵母双杂交技术，筛选出与激活素ⅡA型受体（ActRⅡA）相互作用蛋白的基因片段，再以此基因片段作为探针，从小鼠脑cDNA文库中钓取ActRIP5 cDNA。采用哺乳动物细胞双杂交系统，进一步确定ActRIP5与ActRⅡA的相互作用。采用RT-PCR检测ActRIP5 mRNA在组织中的转录。结果克隆的ActRIP5全编码基因长1839bp，编码145个氨基酸残基，与ActRⅡA具有特异结合作用。ActRIP5 mRNA在小鼠多种组织中均可检出。结论ActRIP5属于ActRIP家族新成员，可以与ActRⅡA相互作用。

培养条件对HBsAg转基因人参细胞的生长及表达量的影响40-42

摘要：目的研究培养条件对HBsAg转基因人参细胞生长及HBsAg表达量的影响。方法通过单因子实验，分别考察碳源、氮源、有机成分对HBsAg转基因人参细胞生长和HBsAg表达量的影响，并通过不同组合实验，探索氮源浓度、有机成分和起始pH的最佳组合。结果在3％蔗糖、10mmol／L氮源、0．25％乳清蛋白和起始pH6．2的情况下，细胞生长量略有增加，HBsAg的表达量增加1倍。结论通过改善培养条件，可以提高HBsAg转基因人参细胞的生长速度和抗原表达量。

乳糖诱导重组人睫状神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达43-46

摘要：目的利用乳糖替代IPTG，诱导重组人睫状神经营养因子（Recombinant human ciliary neurotrophic factor，rhCNTF）在原核工程菌BL-TCS中可溶性表达，并选择最适的诱导表达条件。方法在不同的温度下，利用不同浓度的乳糖及0．5mmol／L的IPTG，诱导含有人CNTF基因的工程菌9h，比较菌体生长、乳糖消耗以及目标蛋白的表达规律。结果乳糖组的菌体A600值均高于IPTG组。乳糖诱导产生的rhCNTF主要以可溶形式表达，各浓度乳糖的诱导效果均能接近或超过IPTG的效果。以2％乳糖在25℃下诱导6h，可以达到比较好的诱导效果。结论乳糖可取代IPTG诱导人CNTF基因表达，并获得良好效果。

Bcl-2、C-Raf及双靶点RNAi质粒对HCT-8细胞株增殖的抑制作用47-50

摘要：目的研究Bcl-2、C—Raf及双靶点的RNA干扰质粒对人结肠癌HCT-8细胞株增殖的抑制作用。方法利用Ambion公司网上设计软件，分别以Bcl-2和C-Raf为靶标，设计合成63个核苷酸的双链RNA，构建质粒pSilencer 3．1-H1／Bcl-2、pSilencer 3．1-H1／C-Raf及pSilencer 3．1-H1／Bcl-2／C-Raf，分别转染结肠癌细胞株HCT-8，用MTT法检测其对细胞增殖的抑制作用，RT-PCR检测Bcl-2和C-Raf的mRNA转录。结果经MTT法检测，构建的Bcl-2和C-Raf基因及双靶点RNAi质粒3个转染组的细胞存活率均降低，双靶点质粒转染组较两个单靶点转染组细胞存活率明显降低，差异有显著意义。经RT-PCR检测，转染双靶点质粒后，HCT-8细胞中Bcl-2和C-Raf基因的表达均较对照组明显减弱。结论Bcl-2、C-Raf及双靶点RNAi质粒对HCT-8细胞株增殖有抑制作用。

中国生物制品学杂志消息

目前收录《中国生物制品学杂志》的数据库50-50

中国生物制品学杂志预防制品

弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的特异性抗体动态观察51-53

摘要：目的观察弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB／c小鼠后诱导的血清IgG、粪便和鼻咽冲洗液中IgA特异性抗体动态，探讨其抗弓形虫感染作用机制。方法96只BALB／c小鼠随机分为实验组和对照组，实验组以弓形虫复合黏膜疫苗（20μl／只）滴鼻免疫，对照组以PBS滴鼻。分别于滴鼻2次（间隔2周）后第1、2．3、4、6、8、10和12周处死小鼠，收集血清、粪便及鼻咽冲洗液，采用ELISA法检测血清IgG以及粪便和鼻咽冲洗液中IgA抗体。结果实验组小鼠血清IgG、粪便及鼻咽冲洗液中IgA均高于对照组，血清IgG水平第3周达高峰，第1～4、6和8周显著高于对照组；粪便IgA抗体第2周达高峰，第2、3和4周显著高于对照组；鼻咽冲洗液中IgA第1周即达高峰，之后逐渐降低，至第12周仍显著高于对照组。结论弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB／c小鼠可诱导高水平的特异性抗体，且可持续较长时间。

中国生物制品学杂志治疗制品

纯化胸腺肽抗白色念珠菌的效果54-55

摘要：目的观察纯化胸腺肽抗小鼠感染白色念珠菌的效果。方法选取昆明小鼠，建立白色念珠菌感染模型，感染浓度为0．5×10^6个／ml，实验分纯化胸腺肽组、胸腺肽组及空白对照组，实验组给药剂量为1．5mg／kg，对照组接种0．5ml生理盐水，感染前后10d，隔天肌肉注射，观察小鼠各项生命指标及抗感染效果。在最后一次注射后第8天，检测各组小鼠血清溶菌酶含量。结果纯化胸腺肽组各项生命指标均优于胸腺肽组及空白对照组，小鼠血清溶菌酶含量均显著高于空白对照组和胸腺肽组。结论纯化胸腺肽抗白色念珠菌感染的效果优于胸腺肽。