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中国生物制品学 2004年第06期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志论著

HCV聚合酶在大肠杆菌中表达产物的纯化及结构研究337-340

摘要：目的构建HCV聚合酶基因重组原核表达质粒，研究高效表达聚合酶蛋白的最适条件、表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件，同时分析其二级结构，为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物创造条件。方法采用高保真。PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增，从我国HCV RNA阳性病人血清中扩增出HCVNS5b RNA聚合酶全长基因序列，构建原核表达载体。在多个载体中选取pET-30a作为表达载体，选择诱导表达条件。利用Ni^2+金属离子螯和亲和层析将其纯化。同时对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究，对其相关的分子生物学参数和二级结构进行分析。结果测序及读码框架分析结果表明，按照上述技术路线得到了相关HCVNS5b RNA聚合酶全基因序列。在最佳表达条件下，诱导表达融合蛋白(相对分子质量65000)，其最高表达量为18．9％，纯度大于92．83％，Westem blot法检测，能与HCV NS5b单抗反应，证明其为NS5b蛋白。对其二级结构的分析表明，已获得了活性基团完整的HCV聚合酶。结论HCV聚合酶的高效表达和纯化，为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础。

葡萄球菌肠毒素B基因真核表达系统的构建及目的蛋白的鉴定341-343

摘要：目的克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因，构建其真核表达系统并表达目的蛋白。方法采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株中扩增全长SEB，目的片段T-A克隆后测序。重组质粒pLICm-T-SEB经酶切获得的pUCm-T-SEB基因片段与真核表达载体pPIC9K连接。将重组真核载体pPIC9K-SEB转化人P．pastoru GS115株，经PCR筛选并鉴定pPIC9K-SEB-P．pastoris GS115。在0．5％(v/v)甲醇诱导下，采用SDS-PAGE检测重组SEB(rSEB)的表达，并对rSEB的N端氨基酸序列和诱导人脐静脉内皮EVC-304细胞分泌Ⅱ-1α和TNFα的作用进行了检测。结果所克隆的SEB基因核苷酸及氨基酸序列的同源性分别高达98．84％～100％和100％。表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符。rSEB氨基末端氨基酸序列与预期完全相符。rSEB与SEB商品有相似的促人脐静脉内皮细胞：EVC-304分泌IL-1α和TNFα的活性。结论已成功地构建了SEB的真核表达系统，为进一步分析SEB分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础。

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的基因克隆与表达344-347

摘要：目的克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白基因napA，为研究幽门螺杆菌致病机理提供材料。方法用PCR从幽门螺杆菌DNA中扩增出目的基因rapA，定向插入原核表达载体pQV30中，测序分析确认后，转化大肠杆菌DH5a，踟诱导表达，表达蛋白以NI^2+NTA柱进行纯化。结果PCR扩增出435bp目的基因片段napA，克隆入pQE30质粒。工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带，相对分子质量为17000，与预期一致，约占菌体总蛋白的38％，经Ni^2+-NrA柱纯化后可获得纯度为95．5％重组蛋白。Western blot显示重组蛋白具有良好的抗原性。结论克隆napA基因成功，并在大肠杆菌DH5a中高效表达。

产气荚膜梭菌β2毒素基因的克隆及定点突变348-350

摘要：目的克隆产气荚膜梭菌β毒素基因，并选择可能影响其生物活性的氨基酸的相关碱基位点进行定点突变，构建β毒素基因的突变体。方法利用PCR从C型产气荚膜梭菌基因组DNA中，扩增出约0．7kb的基因，将其克隆至pGEM-T载体上。经COLDKEY软件分析抗原表位，PCR定点突变技术进行234位半胱氨酸一苷氨酸的定点突变。结果β毒素基因核苷酸序列与报道的一致，其突变基因699位核苷酸由T→G。结论已成功克隆了β毒素基因，并准确实施了预期定点突变。

大鼠Endostatin在乳酸乳球菌中的克隆与表达351-353

摘要：目的在乳酸乳球菌中克隆与表达大鼠endostatin。方法采用RNA分离试剂盒从大鼠肾脏组织中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增其endostatin基因，将该基因克隆进pUC19质粒中，转化大肠杆菌DH5a，提取质粒，分离基因，酶切后与含有乳酸乳球菌启动子nisin的pLAl41质粒连接，经电击转化，将重组质粒转入乳酸乳球菌N79000中，转化子在含有氯霉素的GM17培养基上培养。用nisin诱导endostatin表达，SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果表达产物相对分子质量约为14000，表达量约为10mg/L。结论在乳酸乳球菌中可以表达出正确的大鼠endostatin重组蛋白，为下一步进行重组蛋白的活性检测以及临床实验提供了依据。

大肠杆菌重组人成骨蛋白-1的非诱导表达特性354-357

摘要：目的研究大肠杆菌重组人成骨蛋白-1的非诱导表达特性。方法通过水质、起始pH、接种量、葡萄糖添加量、甘油添加量、装液量、转速等实验研究不同营养条件和培养条件对OP-1非诱导表达的影响。通过传代实验，考察该系统OP-1表达的稳定性。结果水质对OP-1的表达没有明显影响，2％～4％的接种量有利于OP-1的表达，起始pH以6、0为宜。葡萄糖对OP-1的表达有较大影响，20％-4％的葡萄糖添加量可以获得较高表达。甘油的添加能明显促进OP-1的表达，最适添加量为0、3％，较对照提高表达81、7％。该表达系统对溶氧的需求不大，装液量和转速分别以125．150n1I和150r／min为宜。在优化条件下，最适表达时间为74～26h，OP-1的表达量可达到菌体蛋白的40％。优化的营养条件和培养条件对本系统OP-1的表达和质粒的稳定有利，10次传代可保持90％，表达。结论建立了非诱导表达的摇瓶发酵工艺，对其非诱导表达特性有了较为深入的了解，为进一步放大研究奠定了基础。

H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及分子进化分析358-360

摘要：目的克隆H5N1亚型禽流感病毒HA基因并进行分子进化分析。方法应用RT-PCR方法，以2株RN1亚型禽流感病毒RNA为模板，扩增了HA全基因cDNA。将HA cDNA基因克隆于pUCm-T载体，并对其进行了测序。结果所克隆的HA基因全长为1731bp，共编码568个氨基酸。将该毒株与其它10株H5亚型禽流感病毒HA基因序列核苷酸及氨基酸进行比较，其核苷酸同源性在80．5％-99．2％之间，氨基酸序列同源性在89．4％-98．6％之间。高致病性毒株HA基因裂解位点存在多个碱性氨基酸插入。结论为禽流感基因工程疫苗的研制奠定了基础，同时通过分子进化分析也揭示了各毒株间的亲缘关系。

应用等位基因特异性扩增法快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性361-364

摘要：目的建立一套等位基因特异性扩增(ASA)的检测体系，用于结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。方法根据结核分支杆菌野生型基因设计ASA特异性引物，ASA PCR扩增39株结核杆菌利福平耐药株的rpoB基因，经琼脂糖凝胶电泳检测，进而推断利福平的耐药性；同时进行。DNA序列测定以验证ASA法的检测结果，并分析上海地区结核杆菌rpoB基因的突变特点。结果在39株利福平耐药株中共检出36株，敏感性为92．3％；与DNA测序结果的符合率为87．2％，并鉴定了11种不同类型的41种突变形式，其中包括9种点突变和2种基因缺失。结论用等位基因特异性扩增法分析结核分支杆菌的rpoB基因突变具有较高的特异性与敏感性。该法快速、简便、可靠，可应用于临床利福平耐药性的检测。

截断型人可溶性CD40L的表达与纯化365-368

摘要：目的表达相对分子质量18000的截断型人可溶性CD40L。方法针对人CD40L(Glu108-Leu261)设计引物，以全长人CD40L为模板，扩增目的基因，经pGEM-T中间载体进一步连接到pQD40载体，构建pQE/sCD40L表达载体。转化E．coliMl5后经IPTG诱导表达，分离、洗涤包涵体，并利用M-NTA亲和层析纯化目的蛋白，经复性后检测对骨髓瘤细胞SP2／0细胞株的抑制作用。结果克隆的目的基因为4S0bp，经测序与文献报道一致，所构建的菌株(M15／pQE/sCD40L)经诱导表达目的蛋白量为26．7％，相对分子质量为18000，纯化后蛋白纯度为96．5％，对SP2／0细胞有生长抑制作用。结论原核表达的截断型人可溶性CD40L具有抑制肿瘤细胞生长作用。

人血浆蛋白C的纯化与鉴定369-371

摘要：目的建立人血浆蛋白c的纯化与鉴定方法。方法利用DEAE-Sephadex A-50代替氯化钡，对血浆进行预处理，再经DEAE-Sepharose FF离子交换和肝素-Sephamse CL 6B亲和层析进行分离纯化，用活化的部分凝血活酶时间(APTT)测定组分活性，非还原型SDS-PAGE测定其相对分子质量，Western blot鉴定其特异性。结果获得相对分子质量为62000的蛋白条带，此条带可与人蛋白C单克隆抗体发生特异性反应。结论已成功地从血浆中分离到蛋白C，为其规模化生产奠定了基础。

Vero细胞蛋白过敏原性研究372-373

摘要：目的研究Vero细胞蛋白的过敏原性。方法取不同剂量Vero细胞宿主细胞蛋白和裂解蛋白致敏豚鼠，隔日1次，共3次，每组3只，以牛血清及生理盐水分别为阳性及阴性对照，末次致敏后21d攻击，并观察攻击后的反应。结果攻击后30min，100ng／只以上剂量组均出现过敏反应，且反应强度与剂量呈正相关。2.4h各剂量组过敏反应的恢复情况各不相同。结论Vero细胞宿主细胞蛋白及裂解蛋白均可以引起过敏反应，裂解蛋白的反应强度高于宿主细胞蛋白。

重组人纽兰格林生物学活性检测方法及质控标准374-376

摘要：目的研究重组人纽兰格林生物学活性检测方法，并制定其质量控制标准。方法采用激酶受体活化的酶联免疫吸附试验(KIRA-ELISA)，通过优化细胞浓度、样品稀释梯度、药物刺激时间及细胞裂解方法等建立定量测定重组人纽兰格林体外生物学活性的方法，同时建立了一套完整可行的质量控制标准。结果重组人纽兰格林刺激MCF-7细胞表面ErbB2／ErbB3分子磷酸化的反应存在量一效关系，相关系数大于0．98，原液的平均比活性为8510U／mg±1150U／mg，并对原液设立肽图、纯度等检测项目，对成品设立热原质试验、鉴别试验等检测项目。结论KIRA-ELISA可用于定量检测重组人纽兰格林的体外生物学活性，结果准确可靠，重复性好；建立的方法和标准可以有效控制重组人纽兰格林制品的质量。

新生鼠提取液对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响377-379

摘要：目的探讨新生鼠提取液(NRE)对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响。方法大鼠皮下注射0．1％。肾上腺素0．2ml后放冰水中浸泡5min复制急性血瘀模型，应用NRE进行治疗(NRE2．0和4．0nl/kg每天灌胃给药1次，连续7d)，测定大鼠血液流变学各参数变化。结果急性血瘀模型大鼠全血黏度、血浆黏度、血浆纤维蛋白原浓度、血沉、红细胞聚集指数及红细胞刚性指数均明显降低，红细胞电泳时间及红细胞压积则无明显影响。结论NRE可明显改善急性血瘀模型大鼠血液流变学，对于防止动脉硬化的发展及并发症的发生均有益处。

用微载体系统培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液380-382

摘要：目的采用生物反应器微载体培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液。方法用5L生物反应器培养Vero细胞，培养至4d时接种CTN株狂犬病毒，在培养全程对细胞生长所消耗的营养物质及代谢产物进行监测及分析。结果培养4d后细胞浓度可达1．2×10^7cclk／ml，培养3周后的病毒液经ELISA检测A值可达0．21∽1．06。病毒滴度达10^-6.0∽10^-8.0LogLD50/ml。病毒液可连续收获5次。结论用微载体系统培养Vero细胞可生产高滴度的狂犬病毒液。

流感病毒灭活疫苗新型佐剂——壳聚糖增强免疫作用研究383-384

摘要：目的检测壳聚糖作为流感病毒灭活疫苗佐剂的效果。方法将壳聚糖与疫苗混合经腹腔免疫BALB／c小鼠，间隔3周，免疫2次。免疫后取血清，检测血清中所产生的IgG、IgG1、IgG2a等抗体水平，同时，取小鼠鼻洗液检测IgA抗体；加强免疫后1周，用致死性(40LD50)流感病毒A/PR/8／34(H1N1)攻击小鼠，观察小鼠的体重变化和保护作用。结果壳聚糖作佐剂能显著增强血清抗体含量，并提高小鼠抗病毒攻击的能力。结论壳聚糖作为流感病毒灭活疫苗的新型佐剂，可以增强疫苗的抗体反应。

6省市28株钩体菌株血清学检定及2个新型菌株的发现385-387

摘要：目的为了解洪涝灾害对钩端螺旋体(钩体)病流行菌型的影响，在我国钩体病流行比较严重的省市地区进行菌株分离观察。方法采用经典的显微镜凝集试验和交叉凝集素吸收试验进行血清学分类比较。结果6省市的28株钩体菌株分属7个血清群9个血清型，其中发现2个新的血清型，暂定为贺岩型和沅江型，代表菌分别为L231株和沅江27株。结论对流行区的28株钩体菌株进行了血清学分类，为钩体病的诊断提供了新的依据。

肺炎球菌溶血素提取及其免疫学效果观察388-390

摘要：目的提取23F型肺炎球菌溶血素(PLY)，并对其免疫原性、抗原性及保护效果进行初步观察。方法通过离子交换层析、疏水共价层析和排阻层析，从23F型肺炎球菌中提取PLY，以20μg的PLY免疫小鼠(0、14及21d)，末次免疫后14d用23F、9V和2型肺炎球菌从鼻腔粘膜攻击，观察保护效果。结果成功获得PLY，并能诱导小鼠产生较高水平的相应抗体；试验组小鼠存活率显著高于对照组小鼠。结论PLY具有良好的免疫原性，对小鼠具有特异保护作用和交叉保护作用。

重组人白细胞介素-4融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达的影响因素391-392

摘要：目的提高人重组白细胞介素4(rhIL-4)在大肠杆菌中的表达量。方法研究rhIL-4的体外诱导条件，包括诱导时间、INTG浓度、诱导温度、菌体密度对表达量的影响。结果最佳表达条件是诱导时间为4h，诱导温度为42℃，‰为0．7∽1．0，而rhIL-4的浓度对表达量无显著影响。结论诱导时间、诱导温度和菌体密度的优化能提高外源基因在大肠杆菌中的表达产量。