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中国生物制品学 2004年第05期杂志 文档列表

中国生物制品学杂志论著

采用基因拼接方法构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库257-260

摘要：目的 构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库。方法 从抗乙型肝炎病毒表面抗体高滴度(1：1024)的人全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，经RT-PCR分别扩增出轻链可变区和重链可变区，再以噬菌体质粒为模板分别扩增出轻链恒定区(Cκ)和重链恒定区(CH1)，将轻链可变区和轻链恒定区(Cκ)及重链可变区和重链恒定区(CH1)进行第1次基因拼接，分别形成κ轻链和Fd重链，再以κ轻链和Fd重链作为模板进行第2次基因拼接，形成完整的Fab基因，与pComb3H-SS噬菌体质粒连接后，电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue。结果 通过多次电穿孔转化，获得总容量为4×10^5库容的噬菌体抗体库。结论构 建的Fab抗体库可用于筛选特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子。

大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段的免疫原性分析261-263

摘要：目的 分析大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段(简称TTC)的免疫原性。方法 利用分子生物学技术在大肠杆菌中表达破伤风毒素C片段，用阴离子交换层析和金属离子螯合亲和层析方法进行蛋白纯化。参照2000年版《中国生物制品规程》的方法检测表达产物的效价。用间接血凝实验检测免疫动物血清中的破伤风抗体单位。结果 重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的15％。纯化后蛋白纯度达到96．5％。免疫效价为18．706IU／mg，E％为20μg。1μgTTC经4次免疫能诱导机体产生足够的抗体，保护动物免受破伤风毒素的攻击。结论 重组蛋白具有良好的免疫原性，为开发基因工程疫苗奠定了基础。

禽流感病毒核蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达264-266

摘要：目的 以1株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板扩增NP全基因cDNA，并在大肠杆菌中进行表达。方法提取禽流感病毒RNA，以RT-PCR法扩增编码NP基因cDNA并测序，将其克隆到pET-28a原核表达载体，并在大肠杆菌B121(DE3)plysS中表达，用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。结果 所克隆的核苷酸片段包含了核蛋白基因完整阅读框架，编码498个氨基酸，构建的重组表达载体在大肠杆菌B121(DE3)plysS中表达出相对分子质量约为55000的重组蛋白，该重组蛋白具有良好的免疫原性。结论 已成功克隆和表达了禽流感病毒核蛋白基因，为禽流感新型免疫学诊断试剂的研制奠定了基础。

质粒介导的NDRG2 shRNA抑制其在人肿瘤细胞HHCC中的表达267-269

摘要：目的 构建含有针对NDRG2的shRNA的质粒，抑制NDRG2在HHCC细胞中的表达。方法 用PCR方法从人基因组DNA中扩增出336bp的U6启动子，与29bp的NDRG2靶序列的反向重复序列和pSNAV质粒相连。连接后的pSNAVU6质粒转染入HHCC细胞，检测它们对NDRG2表达的影响。结果 pSNAVU6重组质粒能抑制NDRG2的表达。结论 针对NDRG2的短的发夹RNA能抑制NDRG2在HHCC细胞中的表达。

幽门螺杆菌粘附素hpaA和霍乱毒素B亚单位ctx B融合基因的原核表达270-273

摘要：目的 构建幽门螺杆菌粘附素(hpaA)和霍乱毒素B亚单位(ctx B)融合基因的原核表达载体，诱导表达并进行纯化。方法 用PCR扩增hpaA和ctx B两个目的基因片段，克隆至同一pQE-30表达载体中，构建含双基因的表达质粒pQE-hct，转化E．coli DH5α，经IPTG诱导表达融合蛋白HCT；经Western blot分析其免疫原性，采用镍离子柱进行纯化。结果 经测序HCT融合基因片段由1161 bp组成，为编码387个氨基酸残基的多肽。经SDS-PAGE分析相对分子质量约为40000。可溶性蛋白占菌体总蛋白的25％以上，经亲和层析后可获得纯度为92％以上的重组融合蛋白。经Western blot检测可被Hp全菌抗血清和CT抗血清识别。结论 已成功构建融合蛋白HCT的原核表达载体并能高效表达，为研制Hp口服疫苗提供依据。

钩端螺旋体黄疸出血群赖株LipL41基因的克隆表达及鉴定274-276

摘要：目的 对钩体黄疸出血群赖株LipL41基因进行克隆、表达及鉴定。方法 采用高保真PCR．从我国钩体黄疸出血群赖株基因组中扩增全长LipL41基因片段，并构建原核表达系统。结果 所克隆的LipL41基因核苷酸和氨基酸序列与已发表LipL41基因序列(cenbank L46794)同源性分别为96．25％和98.87％；所表达的目的蛋白经Westem blot证实为具有良好免疫反应性的广谱抗原。结论 可作为研制基因工程疫苗的候选抗原。

《药物新剂型产品、新辅料及新技术汇编》（第二集，分上下册）276-276

人抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）在毕赤酵母中可溶性表达277-279

摘要：目的 研究重组AT-Ⅲ基因在巴斯德毕赤酵母菌中进行表达。方法 将携带AT-Ⅲ基因的表达载体电转染GS115细胞，用G418筛选抗性克隆，用SDS-PAGE及Westem Blot检测表达产物的纯度及特异性；用生化法检测AT-Ⅲ的表达量；用凝血酶空斑法检测表达产物活性。结果 表达产物能与抗AT-Ⅲ单克隆抗体结合，并具有天然AT-Ⅲ的生物活性。结论 已在毕赤酵母菌中成功地表达了AT-Ⅲ。

运用SELEX技术筛选特异性高亲和IVB型纤毛结构蛋白RNA适配子280-283

摘要：目的 获得特异性高亲和IVB型纤毛结构蛋白prepilS的RNA适配子(aptamers)，为开发预防、治疗伤寒杆菌肠热症的新型药物试剂奠定基础。方法 采用SELEX技术(Systematic Evolution of Ligandsby Exponential Enrichment)筛选IVB型纤毛结构蛋白prepilS的特异性适配子，通过体外构建一个长度为88nt含有30个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库，PCR扩增为双链DNA随机文库后，体外转录构建RNA随机文库，以Sepharose 4B为筛选介质，筛选具有特异性高亲和力prepilS蛋白的RNA适配子。结果经8轮筛选获得具有特异性高亲和prep／／S蛋白的RNA适配子库。结论成功地筛选出具有特异性高亲和力的RNA适配子库，该RNA适配子库可显著抑制伤寒杆菌侵入THP-1细胞。

人巨细胞病毒gB基因真核表达载体的构建与鉴定284-286

摘要：目的 克隆人巨细胞病毒(HCMV)gB基因并构建真核表达载体。方法 根据Genebank中HCMV核苷酸序列设计引物，并在引物的5′端分别加入BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶位点，特异性扩增gB编码基因片段。TA克隆后经双酶切、PCR、测序等鉴定重组质粒，再经双酶切、连接构建含HCMV gB编码基因的真核表达载体，转染COS7细胞，通过间接免疫荧光法(IFA)检测该重组真核表达载体在COS7细胞中的表达。结果 重组质粒经BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切成大小为5．0kb与2．7kb的片段，表明表达载体pcDNA3．1中插入了HCMV gB基因片段，测序结果表明读码框正确。重组表达载体pcDNA3．1／gB转染COS7细胞后，经IFA检测胞浆中可见黄绿色荧光。结论 成功构建了pcDNA3．1／gB真核表达载体，并可在COS7细胞中表达。

问号钩体Ⅱ型分泌系统相关基因特征分析287-289

摘要：目的 分析问号钩体Ⅱ型分泌系统相关基因特征。方法 根据问号钩体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库，应用BLAST，Tmpred，Pfam等软件分析问号钩体Ⅱ型分泌系统的基因组成和编码蛋白的结构特征，并比较问号钩体与铜绿假单胞菌和大肠埃希菌K12Ⅱ型分泌系统组成蛋白的同源性。结果 问号钩体中与Ⅱ型分泌系统相关的蛋白有11个，其中6个为一般分泌途径蛋白，5个为See分泌途径蛋白，问号钩体中可能存在Ⅱ型分泌系统，但一些辅助蛋白未发现，需要进一步研究。结论 初步预测了问号钩体中Ⅱ型分泌系统的作用模式，为深入研究问号钩体的致病机制奠定基础。

rhIFN-β1a cDNA在CHO细胞上的表达290-293

摘要：目的 在CHO细胞上表达rhIFN-β1a cDNA。方法 利用脂质体技术，将含hIFN-β基因的pRC／CMV-IFNβ-DNA载体和pSV2dhfr-DNA质粒按3：1的比例转染CHO-k 1dhfr-细胞，后者是选择性标记。筛选在缺乏胸腺嘧啶的选择培养基生长的单个细胞克隆，通过MTX加压扩增与dhfr基因共转染IFNβ基因。筛选的细胞株通过大规模培养，收集培养液经一系列的步骤纯化。结果 能够耐受0．6μmol／LMTX的细胞可产生IFN 10^5 unit per day/10^6 cells，CHO细胞中表达的rhIFN-β纯化后的抗病毒比活性可达2．2×10^8 IU／mg。结论 建立了适合表达人干扰素-β的CHO细胞株。

治疗用鼠抗人单克隆抗体WuTac功能及药效作用294-296

摘要：目的 研究鼠源性抗人白细胞介素2受体单克隆抗体WuTac的功能和药效作用。方法 采用间接免疫荧光法检测WuTac对白细胞介素2的阻断作用；采用同位素法检测WuTac对活化的T细胞增殖的影响，并且通过移植物抗宿主的反应(GVHR)对WuTac体内的药效作用进行评价。结果 WuTac可以明显地抑制人白细胞介素2的作用，并且可以明显地抑制移植物抗宿主的反应。结论 WuTac可以作为一种较为理想的免疫抑制剂，用于预防和治疗骨髓移植中GVHR及器官移植的急性排斥反应。

冻干甲型肝炎-腮腺炎联合疫苗的研制297-299

摘要：目的 制备冻干甲型肝炎-腮腺炎联合疫苗。方法 采用L-A-1株和S79株减毒株制备的甲型肝炎减毒活疫苗和腮腺炎活疫苗原液，按一定比例配比，加入适宜保护剂制备成冻干制剂，参照2000年版《中国生物制品规程》进行全面检定及稳定性试验。结果 两种抗原检定结果符合规程单价疫苗质量标准，37℃和2～8℃放置不同时间稳定性良好，联合疫苗中两种抗原无干扰。结论 成功制备了冻干甲型肝炎-腮腺炎联合疫苗。

降低乙型肝炎疫苗中硫柳汞浓度的研究300-302

摘要：目的 研究在保证产品安全性的前提下，降低硫柳汞浓度的可行性。方法 在含有不同浓度硫柳汞的乙肝疫苗中加入已知浓度的活微生物，定期取样检测活菌含量。结果 硫柳汞含量为1．0～2．0μg/ml的乙肝疫苗对所测试微生物有较好的杀灭效力，符合美国药典和英国药典对添加防腐剂注射剂的抗微生物效力要求；并且经十万级和万级环境下的培养基灌封实验证明抑菌、杀菌效力能够满足要求。结论 乙肝疫苗的硫柳汞浓度由目前的50μg/ml降低到1．0～2．0μg/ml仍能保证产品的安全性。

ISCOMS重组乙型肝炎疫苗的研究303-306

摘要：目的 提高CHO细胞表达的重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的免疫原性。方法 采用透析法制备HBsAg免疫刺激复合物(immunostimulating complexes简称ISCOMS)。用放免法(RIA)检测免疫小鼠的抗体滴度；氚标记胸腺嘧啶掺入法(^3H-TdR)检测小鼠脾淋巴细胞转化率；CTLL-细胞株／XTT法检测IL-2活性。结果 经电镜观察ISCOMS颗粒呈蜂窝状，直径为30～40nm左右。SDS-PAGE分析，制备的ISCOMS颗粒HBsAg蛋白均由P23、GP27和GP30组成。用Bradfords法测定ISCOMS蛋白回收率为41．50％。免疫NIH小鼠结果显示ISCOMS重组乙肝疫苗和铝佐剂疫苗的Ⅱk分别为103．2255和25．8064；ISCOMS组的相对效力是铝佐剂组的4倍。刺激指数(SI)分别为6．78±2．32和3．12±0．54。IL-2水平分别是10．2IU／ml±2．12IU／ml和4．95IU／ml±0．86IU／ml。结论 ISCOMS重组乙型肝炎疫苗稳定性好，免疫原性强，抗体产生早，滴度高，并且能激起细胞免疫，有可能发展成为新一代疫苗。

采用低pH法灭活人乙型肝炎免疫球蛋白中的病毒307-308

摘要：目的 考察人乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)于低pH孵放下，其病毒灭活情况，及对抗-HBs效价、IgC组份的影响。方法 将HBIG原液调pH至4．0于2，4℃±1℃孵放21d，以及将成品于2～8℃放置3年比较抗-HBs、IsG各组份指标的变化。结果 HBIG原液按上述条件病毒灭活效果可达到7．00log TCID50／0．1 mL以上，抗-HBs效价、IgG单体与二聚体(D+M)的含量均有所下降。成品2～8℃放置3年，抗-HBs效价、IgG单体与二聚体的含量较稳定。结论 人乙型肝炎免疫球蛋白经低PH灭活病毒法灭活病毒有效，灭活后，抗-HBs效价、IgG单体与二聚体之和均有所下降，但其成品放于2～8℃，抗-HBs效价、IgG单体与二聚体含量较稳定。

吸附纯化乙型脑炎灭活疫苗的研制309-310

摘要：目的 建立简便、适合大规模生产的纯化工艺，用以生产纯化乙型脑炎灭活疫苗，提高乙型脑炎灭活疫苗的质量。方法 按乙型脑炎灭活疫苗的制造方法获得灭活的乙型脑炎病毒液，经超滤浓缩、凝胶过滤柱层析纯化以及氢氧化铝吸附制备试验疫苗，并按新生物制品注册要求考察质量情况。结果 纯化后的层析收集液有效地去除了原疫苗中的大部分杂蛋白，制备的试验疫苗各项质量指标均符合规定。结论 用此工艺制备的纯化疫苗质量可靠，有希望成为原制乙型脑炎灭活疫苗的换代产品。