摘要：【目的】针对生产中危害严重的3 种蔬菜土传病原菌瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae),建立三重PCR(triplex PCR)检测体系,为蔬菜土传真菌病害的早期诊断和鉴定提供技术与方法。【方法】筛选3种病原菌特异性引物组合,通过设定不同的PCR 退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响三重PCR 扩增的因素,建立蔬菜土传病原菌三重PCR检测体系,并对体系灵敏度进行检测。为了验证建立体系的稳定性,选择2×Taq Master PCR Mix(北京博迈德生物技术有限公司)和TaKaRa Taq 酶(大连宝生物工程有限公司)2个不同公司的试剂,分别利用C1000 TouchTM型(赛默飞世尔科技有限公司)与Aeris^TM型(新加坡艺思高科技有限公司)热循环仪进行三重PCR 反应,比较检测结果的可重复性。对田间采集的35 份病害样本和149份土壤样本,分别进行三重PCR 和病原菌分离检测,以确定所建立得三重PCR 检测体系的适用性。【结果】三重PCR反应体系中引物对AsAPH2B/AsPyF、FOF1/FOR1、VActF/VActR 可分别扩增出瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌长度为163、328 和530 bp 的特异性目的片段。反应体系(25 μL):0.12 μmol·L^-1 AsAPH2B/AsPyF,0.16 μmol·L^-1 FOF1/FOR1,0.24 μmol·L^-1 VActF/VActR,2×Taq MasterPCR Mix 12.5 μL,退火温度为60.8℃,35个循环。该体系对病原菌纯培养物的检测灵敏度为10^-1 ng·μL^-1,对土壤中大丽轮枝菌、尖镰孢和瓜果腐霉的检测灵敏度分别为10^5、10^6个孢子/g 土壤和10^-2 mg 菌丝/g 土壤。分别采用2×Taq Master PCR Mix 和TaKaRa Taq 酶,利用C1000 Touch^TM 型和Aeris^TM 型热循环仪进行三重PCR,扩增结果一致,说明三重PCR体系检测稳定性好。对田间采集的病害和土壤样本进行检测,25份病害样本和71份土壤样本中检测出带菌,三重PCR 检测与病原菌分离培养结果一致。【结论】本研究建立的�