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中国农业科学 2019年第03期杂志 文档列表

中国农业科学杂志作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

水稻耐淹成苗率相关性状全基因组的关联分析385-398

摘要：【背景】耐淹成苗率低是限制直播稻产量的重要因素,挖掘高种子活力、低氧萌发能力强的水稻材料是提高耐淹成苗率的关键,但控制耐淹成苗率的遗传位点的挖掘仍然比较有限。【目的】利用来源广泛的自然种质,分析影响耐淹成苗率的关键表型性状,挖掘相关的遗传位点和候选基因,为直播稻耐淹成苗机理研究提供一定的理论和材料基础。【方法】以200份来源广泛的水稻种质为材料,在有氧环境下进行发芽试验,测量种子发芽率、发芽指数和活力指数;在低氧条件下测量芽鞘长和芽鞘直径;进行耐淹成苗试验,水深10 cm,20 d后测量耐淹成苗率。分析各性状间的相关性,挖掘影响耐淹成苗率的关键性状;利用简化基因组测序对以上6个表型进行全基因组关联分析,鉴定与性状显著关联的SNP位点,并在关联区间内筛选候选基因;对02428和YZX 2份材料进行有氧、无氧以及氧气含量转换条件下的转录组检测,结合全基因组关联分析结果,分析候选基因的表达模式差异。【结果】种子活力、芽鞘表型和耐淹成苗率在200份材料间存在广泛的遗传变异,其中,芽鞘长和活力指数的变异系数最大;相关分析结果表明,芽鞘长、活力指数与耐淹成苗率呈极显著正相关;通过全基因组关联分析,共鉴定出8个与活力指数显著关联的位点,15个与芽鞘长显著关联的位点;结合基因组注释,在关联区间筛选出6个与活力指数相关的候选基因,7个与芽鞘长度相关的候选基因;进一步比较13个基因在有氧、无氧及氧气转换条件下的表达模式以及表达量的变化,发现Os02g0657000、Os03g0592500、Os08g0380100表达量变化显著,表现出对氧气处理的敏感性。【结论】种子活力、芽鞘长与耐淹成苗率密切相关,可作为筛选高耐淹成苗水稻材料的重要性状。全基因组关联分析、转录组分析与基因表达模式比较的联合应用可提

苯磺隆胁迫下油菜萌发期相关性状的全基因组关联分析399-413

摘要：【目的】研究苯磺隆残留对油菜种子萌发的影响,运用全基因组关联分析(genome-wide association analysis,GWAS)揭示苯磺隆胁迫下油菜萌发期相关性状的遗传因子和候选基因,探究油菜在苯磺隆逆境胁迫下的生理形态所反映的基因调控机制,为耐苯磺隆油菜品种的研究提供参考。【方法】以241份甘蓝型油菜品种(系)为材料、25 mg·L-1苯磺隆溶液为处理液、蒸馏水为对照进行发芽试验。发芽7 d测定并计算相对发芽率、相对根长和相对鲜重。结合芸薹属60K SNP芯片分析群体基因型,通过STRUCTURE软件和TASSEL软件分别对该群体进行群体结构分析以及亲缘关系和LD衰减分析。为有效排除假关联的影响,采用一般线性模型(GLM)和混合线性模型(MLM)中的6种模型进行比较,确定每个性状GWAS分析的最优模型。同时,利用TASSEL软件在最优模型下对241份材料的3个性状分别进行全基因组关联分析,根据关联SNP位点的LD区间序列预测候选基因。【结果】241份品种(系)群体可分为P1(94份材料)和P2(147份材料)2个亚群,其中约56.28%的材料之间的亲缘关系值为0。全基因组关联分析(K+PCA模型)共检测到16个与性状显著关联的SNP位点,这些位点可解释9.42%—13.14%的表型变异率。通过分析显著SNP位点的LD区间与甘蓝型油菜对应的区间序列,筛选出25个候选基因可能与油菜耐苯磺隆有关,其中9个为细胞色素P450家族基因,5个参与谷胱甘肽合成或代谢过程,2个为多药耐药相关蛋白基因。同时发现与相对发芽率显著相关的基因ATGSTU19编码谷胱甘肽转移酶,参与毒素分解过程,在各种胁迫反应中起重要作用。在相对根长和相对鲜重共同鉴定到的候选基因BnaC02g27690D功能未知。【结论】共检测到16个SNP位点与耐苯磺隆性状显著关联,筛选出25个候选基因可能与油菜耐苯磺隆有关。

60Co-γ射线对2种狼尾草属牧草的诱变效应414-427

摘要：【目的】探究60Co-γ射线对'热研4号'杂交狼尾草及'华南'象草的诱变效应,创制新种质,以推动狼尾草的育种工作。【方法】在前期剂量筛选基础之上,以2种狼尾草品种('热研4号'杂交狼尾草和'华南'象草)种茎为材料,利用60Co-γ射线进行辐射,剂量为30 Gy,剂量率为1 Gy·min-1。将辐射后的种茎与未辐射的种茎栽植于大田中,常规田间管理,1个月后统计成活率。待成活的植株生长成熟后,在2个诱变系群体中分别随机挑选30株进行形态指标的测定,共测定7个指标。随后利用分子标记探究辐射对遗传变异的影响。【结果】2个品种的辐射材料,分别随机选取30株进行形态指标测定,与对照相比,发现'热研4号'诱变系中有28株的株高,21株的茎节数及17株的叶宽有显著或极显著差异。'华南'诱变系中有20株的株高有显著或极显著差异,其他形态指标差异不大。2种牧草的突变体大都表现出株高的降低,因此,生物量也随之减少。还发现一个辐射材料RY4-17,由于分蘖数多于对照导致生物量增加。SSR分子标记研究结果表明,在'热研4号'诱变系中,20对引物的平均多态信息含量为0.245,共扩增出83条带,其中多态性条带52条,诱变系与对照之间的遗传相似系数为0.67—0.89,平均值为0.81,差异位点数为9—27,平均为15.9个,UPGMA聚类结果显示突变体RY4-9和RY4-23与对照遗传距离最远,变异程度最大。在'华南'诱变系中,20对引物的平均多态信息含量为0.394,共扩增出81条带,其中多态性条带65条,诱变系与对照之间的遗传相似系数为0.54—0.86,平均值为0.77,差异位点数为10—38,平均为18.8个,UPGMA聚类结果显示突变体HN-24与对照遗传距离最远,变异程度最大。【结论】适宜剂量的60Go-γ射线辐射可以使2种牧草种茎成活率显著降低,同时可以有效诱导2种牧草在形态学和遗传学水平上发生变异。60Go-γ射线辐射诱变是解决狼尾�

中国农业科学杂志耕作栽培·生理生化·农业信息技术

水氮耦合及种植密度对绿洲灌区玉米光合作用和干物质积累特征的调控效应428-444

摘要：【目的】针对土壤水分、氮肥供应不足以及玉米早衰、种植密度不合理等严重制约绿洲灌区玉米的生产问题,通过研究不同水氮配比及种植密度对玉米光合作用、干物质积累特征和产量的影响,以期为该区玉米高产、稳产提供技术支撑。【方法】2016—2017年,于河西绿洲灌区进行大田试验,以先玉335为参试品种,采用裂裂区设计,灌水水平(W1:4 050 m3·hm-2,W2:3 720 m3·hm-2)做主区,施氮水平(不施氮N0:0,低施氮N1:300kg·hm-2,高施氮N2:450 kg·hm-2)为裂区,种植密度(低密度D1:75 000株/hm2,中密度D2:97 500株/hm2,高密度D3:120 000株/hm2)为裂裂区,测定光合速率、干物质积累量和产量等指标。【结果】施氮量、种植密度对玉米全生育期净光合速率、干物质最大增长速率及其出现天数、干物质积累量、产量、WUE和氮肥利用率有显著影响。水肥耦合可增强玉米密植条件下的光合作用,提高干物质最大增长速率,提前干物质最大增长速率出现的天数,增大干物质积累量和产量。在减量20%灌水和高施氮水平下,中密度处理的全生育期净光合速率较低密度和高密度分别提高17.31%和11.43%;高密度和中密度处理的干物质最大增长速率及最大增长速率出现天数较低密度处理分别提高21.07%、7.52%和提前6.7 d、4.1 d;高密度处理的干物质积累量较中密度、低密度分别提高4.27%和10.59%,中密度处理的产量、水分利用效率和氮肥利用率较低密度、高密度处理分别提高24.2%、11.4%、29.9%和29.2%、18.4%、13.8%。在减量20%灌水条件下,中密度高施氮处理的全生育期净光合速率、干物质积累量和产量分别较中施氮、不施氮分别提高7.34%、11.63%、14.63%和49.54%、44.53%、69.03%;高密度高施氮处理的干物质最大增长速率及最大增长速率出现天数较中施氮、不施氮分别提高19.07%、54.35%和提前3.9 d、6.8 d;同等密度高施氮处理的氮肥利用�

基于GIS的云南山区玉米生态适宜性评价方法与应用445-454

摘要：【目的】作物适宜性评价是进行生产区划的重要手段,本研究拟基于气象、土壤、地形数据,构建适宜山地环境的玉米生态适宜性评价模型和方法。【方法】在文献系统分析的基础上,遴选18个生态指标构成玉米生态适宜性评价指标体系,气候适宜性评价模型采用作物模型法构建,考虑了玉米生育期和生态效应,其他指标采用隶属度函数法分数值型和概念型分别构建。各因子权重采用专家打分和层次分析法确定,综合权重和适宜性函数构建玉米气候、土壤养分、立地条件、土地管理适宜性评价模型及综合生态适宜性评价模型。评价的数据通过空间分析获得。针对山区耕地的立体分布特点,运用ArcGIS工具综合耕地利用、土壤类型、行政区划划分评价单元,经GIS的插值处理、统计分析,获得各评价单元18个评价指标基础数据,进而运用评价模型对各评价单元进行分类评价和综合生态适宜性评价。【结果】该方法应用于云南省寻甸县,全县耕地共划分为8 415个评价单元,其气候、土壤养分、立地条件、土地管理4个方面适宜以上的面积分别占比58%、86%、42%、90%。生态适宜性综合评价中,高度适宜区和适宜区的面积占比分别为35.4%、50.6%,主要分布在中-东南部低中山丘陵区,中北部金沙江河谷,西部河谷槽区也有小范围的分布;勉强适宜区、不适宜区面积占9.4%和4.6%,主要零星分布在中部以西地区,而在西北部相对集中。【结论】评价方法考虑了玉米生育期和山区耕地立体分布特点,研究区适宜性区划呈碎片状分布,分布情况与区域生产情况基本相符,气候和立地条件是影响研究区玉米生态适宜性的主要因素。

中国农业科学杂志植物保护

黄萎病不同发生程度棉田土壤中的真菌群落特征分析455-465

摘要：【目的】真菌是土壤微生物系统的重要组成部分,对土壤环境变化有明显的指示作用。本研究对黄萎病不同发生程度棉田土壤中的真菌群落特征进行分析,旨在探明大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)入侵棉田对土壤中真菌多样性和群落结构的影响,揭示土壤中真菌群落在棉花黄萎病发生过程中的生态作用。【方法】以阿克苏、石河子不同发病程度棉田和库尔勒人工接菌棉田为研究对象,从中采集6个土壤样品:阿克苏重病田土壤(AD)、阿克苏对照田土壤(ACK)、石河子重病田土壤(SD)、石河子对照田土壤(SCK)、库尔勒重病田土壤(KD)、库尔勒对照田土壤(KCK)。采用Illumina Hiseq高通量测序技术,研究土壤中真菌的多样性及群落结构,结合冗余分析(RDA)明确真菌群落结构与土壤养分的相关性。【结果】在97%相似度水平下,AD和SD样品中真菌的OTU数量、Chao1和Ace丰富度指数均分别高于其对照ACK、SCK,而Simpson指数均分别低于其对照;人工接菌的KD与其对照KCK样品之间OTU数量、Chao1和Ace丰富度指数以及Simpson指数均无显著差异。NMDS分析表明,AD、SD土壤样品首先表现为明显的空间趋向性,之后表现为时间趋向性,而库尔勒土壤样品则首先表现为时间趋向性,其次是空间趋向性。群落组成方面,在门水平上,土壤中Ascomycota的丰度占绝对优势,其次为Basidiomycota和Mortierellomycota,3个门在KD与KCK样品之间以及SD与SCK样品之间的丰度差异较小,而在AD和ACK样品之间丰度差异较大;在属水平上,Sporobolomyces的丰度最高,其与Mortierella在不同区域重病田土壤中丰度均高于对照,而Wardomyces均低于对照。此外,AD样品中Pyrenochaetopsis、Microdochium、Fusarium的丰度均低于ACK,而此3个属在SD样品中的丰度均高于SCK样品。组间差异显著分析表明,库尔勒、石河子土壤中的显著差异标记均主要富集于重病田中,而阿克苏土壤中显著差

褐飞虱一个新的海藻糖合成酶基因的特性、发育表达及RNAi效果分析466-477

摘要：【背景】昆虫海藻糖合成酶基因是昆虫海藻糖合成的主要基因,大多数昆虫中只拥有一个海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因,部分昆虫存在一个海藻糖-6-磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)基因。前期研究发现褐飞虱(Nilaparvata lugens)中拥有两个TPS,对其功能研究发现TPS不仅能够调控海藻糖代谢,还可介导海藻糖酶调控几丁质合成与降解途径,控制昆虫的蜕皮过程。【目的】通过对褐飞虱转录组测序分析获得了一个新的TPS,检测该基因在褐飞虱不同发育阶段的表达情况,探究该基因的功能与前期发现的两个TPS的区别。【方法】对获得的新TPS基因序列采用克隆技术获得全长c DNA序列,经验证正确后,对其蛋白的一级、二级、三级结构及与其他昆虫的TPS进行比对分析,最后采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术测定3个不同TPS在褐飞虱不同发育阶段的表达,并采用RNA干扰(RNAi)技术抑制TPS3的表达。【结果】在前期研究的基础上,克隆出一个新的TPS,并命名为TPS3。TPS3开放阅读框长度为2 352 bp,编码783个氨基酸,预测蛋白分子量为88.9 kD,等电点为5.47,具有亲水性结构。生物信息学分析表明,褐飞虱3个TPS蛋白具有较高的同源性,都具有TPS和TPP两个保守结构域及其他特征序列,并且α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲所占的比例较为接近。褐飞虱不同发育阶段3条TPS的相对表达量不同,TPS1的相对表达量从4龄0 h开始逐渐上升,至成虫阶段达到最高,TPS2的相对表达量从4龄末期开始明显上升且在整个5龄阶段都有较高的表达,TPS3的相对表达量在5龄末期和成虫初期较高。单独干扰褐飞虱TPS3 48 h后被干扰基因的相对表达量下降,ds TPS3能有效抑制TPS3的表达。【结论】在褐飞虱中发现一个新的TPS(TPS3),其与褐飞虱中已经报道的TPS1和TPS2具有较高的同源性。不同发育阶段表达结果表明,3�

中国农业科学杂志土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

基于遥感与作物模型的土壤速效养分时空变异分析478-490

摘要：【目的】研究在均衡施肥模式下,双山农场2012—2016年间土壤速效养分的时空变异特征,分析施肥管理、轮作模式等人为因素和气象、地形等自然因素对速效养分变化的影响,该研究成果可为土壤速效养分管理和作物变量施肥提供参考依据。【方法】以双山基地农场为例,通过时间序列HJ-1 CCD遥感数据和作物模型WOFOST反演得到土壤速效养分。基于以上土壤速效养分数据在不同时间尺度(年际间和生长季内)和不同空间尺度(农场尺度和田块尺度)上的速效养分时空变异分析。利用土壤速效养分分级图来定性分析养分在5年内的空间变异特征;选取相应的统计参量对土壤速效养分的平均含量和变异性进行定量分析;利用线性回归来分析速效养分的变化量与初始含量的关系;以及养分变化曲线图分析速效养分的时间变化特征。【结果】在均衡的农田施肥管理模式下,2012—2016年农场的土壤速效氮(AN)、速效磷(AP)和速效钾(AK)含量平均值变化不大,速效养分高值和低值都在向中间值靠拢,分别集中于280—360 mg·kg-1、38—42 mg·kg-1和160—200 mg·kg-1,该部分面积比例分别增加18.5%、23.1%和23.8%,养分含量整体呈现均一化特征。AN、AP和AK的变异系数分别从2012年的0.314、0.112和0.257变为2016年的0.131、0.034和0.098,速效养分分布的空间差异性在减弱。AN,AP变化量均与初始值呈现极显著的负相关,R 2分别为0.839和0.882,AK的R 2为0.569,其相关性较弱与土壤中的速效钾本身不稳定有关。通过相邻地块的养分变化分析可知,田块尺度上的土壤速效养分也表现出明显的均一化特征,轮作模式是影响田块间养分变化差异的主要因素,对于轮作模式完全相反的#1和#2田块,人工施肥决定了田块内养分变化的总体趋势,对于豆科作物,固氮作用对土壤速效氮的含量变化作用明显。温度升高在一定程度上会促进作物

黄淮海平原地区深松和灌水次数对冬小麦-夏玉米节水增产的影响491-502

摘要：【目的】研究黄淮海平原地区冬小麦-夏玉米不同深松时机交互不同灌水次数对作物产量及水分生产效率的影响,为优化黄淮海地区土壤耕作方式提供理论依据。【方法】采用土壤耕作方式与灌水次数相结合的方法,设置秋深松+冬小麦2水(QS-2)、秋深松+冬小麦3水(QS-3)、夏深松+冬小麦2水(XS-2)、夏深松+冬小麦3水(XS-3)、对照(CK)共5个处理,研究深松与灌水次数对冬小麦-夏玉米一年两熟农田土壤物理性质、植株生长发育、产量、总产出值及水分生产效率等的影响。【结果】深松和灌水次数对土壤容重、土壤紧实度、土壤储水量、总产出值、水分生产效率均有不同程度显著影响。与对照相比,QS-2、XS-2、XS-3处理均显著降低深松后第1年土壤耕层(0—40 cm)及深松后第2年0—20 cm土层的土壤容重;深松各处理均显著降低第1年土壤紧实度,对第2年土壤紧实度影响效果不明显;秋深松后第2年QS-2处理的冬小麦整个生育期平均土壤储水量较CK显著增加18.14%,QS-3处理次之,夏深松后第2年XS-2、XS-3处理分别较CK显著提高24.7%、25.6%;秋深松能显著提高当季冬小麦生长发育,QS-2、QS-3处理地上生物量分别较CK增加了19.29%、27.06%,第2年QS-2和QS-3处理地上生物量较CK均有所提高,差异不显著,秋深松对第2年冬小麦生长发育影响效果减弱,夏深松第2年XS-2和XS-3处理的叶面积和地上生物量均较对照显著提高,夏深松能显著促进后茬冬小麦生长发育;QS-2处理对2年冬小麦-夏玉米总产出值和水分生产效率均显著提高,第1年总产出值和水分生产效率分别较CK提高27.21%、23.51%,第2年分别提高19.54%、18.84%,夏深松显著提高第2年冬小麦-夏玉米总产出值及水分生产效率,XS-2处理分别提高18.50%、17.65%,XS-3处理分别提高19.57%、15.35%。【结论】黄淮海平原冬小麦-夏玉米连作采用冬小麦播前秋深松耕作方式,冬小麦全生

中国农业科学杂志园艺

越橘VcNAC072克隆及其促进花青素积累的功能分析503-511

摘要：【目的】分离越橘VcNAC072(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子,分析其表达模式并探讨其在调控花青素合成过程中的功能,为进一步研究越橘花青素积累的调控机理提供理论基础。【方法】以‘公爵’越橘(Vaccinium corymbosum ‘Duke’)为试材,克隆VcNAC072。通过农杆菌介导法获得转基因拟南芥,比较转基因和野生型拟南芥花青素积累的差异。利用酵母单杂交和瞬时表达试验,分析VcNAC072对MYB转录因子AtPAP1的转录调控。【结果】克隆获得越橘VcNAC072,该基因CDS为1 032 bp,编码含有343个氨基酸的蛋白质,含有1个保守的NAC结构域。表达分析显示,该基因在不同发育阶段的果实中均可表达,但表达差异明显,在粉色和蓝色果实中表达量较高,在绿色果实中表达量最低。随着VcNAC072表达的升高,果实中花青素含量呈递增的趋势。分析AtPAP1启动子序列,发现其序列中包含NAC转录因子的结合位点。酵母单杂交和烟草瞬时表达试验结果表明,VcNAC072可与AtPAP1的启动子相互作用,并激活其表达。在野生型拟南芥中异位表达VcNAC072,其种子中花青素积累量显著高于野生型。【结论】推测VcNAC072在越橘果实中正向调节花青素的积累。

二氧化氯处理促进厚皮甜瓜果实的采后愈伤512-520

摘要：【目的】研究二氧化氯(ClO2)处理对厚皮甜瓜果实采后愈伤的影响,为厚皮甜瓜的采后愈伤提供方法和理论依据。【方法】以‘玛瑙’厚皮甜瓜为试材,人工模拟损伤后,用25 mg·L-1的ClO2浸泡损伤果实10 min,于常温黑暗条件下进行愈伤。测定愈伤期间损伤果实的失重率以及损伤接种粉红单端孢果实的病情指数,通过甲苯胺蓝和间苯三酚—盐酸染色法观察聚酚软木脂、聚酯软木脂和木质素在伤口部位的积累,并用IS Capture图像软件对聚酚软木脂、聚酯软木脂和木质素积累量进行分析。测定伤口表面的色度值,分析伤口处组织愈伤期间苯丙烷代谢活性以及过氧化物酶和多酚氧化酶的活性变化。【结果】ClO2处理显著降低了损伤果实的失重率和损伤接种果实的病情指数,愈伤第7天时,处理比对照低10.3%。果实在损伤后不同时间段接种粉红单端孢,经1周培养观察,处理果实的病情指数显著低于对照,第7天时处理果实的病情指数比对照低56.9%。处理显著促进了果实伤口处聚酚软木脂、聚酯软木脂和木质素的积累,处理果实的积累量在愈伤的中后期显著高于对照,三者比对照分别高25.3%、77.7%和35.5%。愈伤期间,处理果实伤口处的L*值显著低于对照,b*值显著高于对照,在愈伤第5天时,处理果实的L*值比对照低6.1%,第3天时的b*值比对照高17.8%。处理明显提高了果实伤口处的苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性,在愈伤第7天时,处理果实伤口处的苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性分别高于对照34.3%、80.5%和15.7%。此外,处理果实伤口处的总酚、类黄酮和木质素含量也显著高于对照,第7天时,分别高于对照14.7%、16.8%和15.6%。【结论】ClO2处理可有效促进厚皮甜瓜果实的采后愈伤,ClO2对愈伤的促进作用与激活伤口处的苯丙烷代谢,提高POD和PPO活性,促进软木脂和木质素�

中国农业科学杂志食品科学与工程

干酪乳杆菌CRISPR基因座分析521-529

摘要：【目的】目前基于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)spCas9为核心的CRISPR/Cas9基因编辑系统在乳酸菌上的应用受到很多限制,亟待开发适合于乳酸菌的基因编辑系统。对6株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的CRISPR系统进行深入分析,并预测激活干酪乳杆菌自身Cas9蛋白所识别的PAM序列,为开发适用于乳酸菌的CRISPR/lcCas9基因编辑系统奠定基础。【方法】以已完成全基因组测序的6株干酪乳杆菌为研究对象,利用生物信息学方法对其CRISPR系统进行深入分析,重点对不同菌株的CRISPR系统结构进行解析,并且对Cas蛋白以及spacer的同源性进行分析,最后对CRISPR区重复序列的二级结构以及Cas9蛋白识别的PAM序列进行预测。【结果】6株干酪乳杆菌CRISPR系统具有相似的结构,均具有特征性的Cas9蛋白,并且Cas基因序列保守。预测到tracrRNA位于Cas9和Cas1之间,重复序列可以形成茎部长达7个碱基的二级结构。根据CRISPR的间隔区序列,6株干酪乳杆菌可被分为3个基因型,将间隔区逐一进行blast比对,结果表明6个间隔区比对上14个来源不同的原间隔序列,这些间隔序列均来源于不同质粒。干酪乳杆菌lcCas9蛋白识别PAM序列的1、3位碱基偏好T/C、A/C,2、4位碱基对G、A的偏好性比较大。【结论】6株干酪乳杆菌CRISPR系统均为type-ⅡA型,Cas序列和重复序列高度保守。DR序列可以形成稳定的二级结构,TGMA为干酪乳杆菌Cas9蛋白高效识别的PAM序列。

中国农业科学杂志畜牧·兽医·资源昆虫

大载体转染猪胎儿成纤维细胞的电转条件优化530-538

摘要：【背景】随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维(porcine Fetal Fibroblasts,PFFs)细胞的转染效率有关。【目的】研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构三方面,比较3种电转仪ECM?830/NEPA21/NucleofectorTM2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件。【方法】使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1×106个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构三方面分别比较瞬时转染效率。【结果】首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEPA 21转染PFFs的效率最高,为13.24%±1.63%,而NucleofectorTM 2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36%±3.95%。然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM?830和NucleofectorTM 2b转染PFFs的最佳质粒用量为12μg,其转染效率分别为8.44%±0.90%(电转参数:脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次)和14.63%±3.21%(电转参数:U-023),而NEPA 21使用10μg质粒转染PFFs时效率达到最高(6.09%±0.72%)。最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96%—48.39%。【结论】因此NucleofectorTM 2b转染PFFs的最佳条件为:U-023程序、12μg超螺旋质粒;NEPA 21为:脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10μg超螺旋质粒;ECM?830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次条件下转染12μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率。综合比较

肉羊精料可代谢蛋白质预测模型的建立539-549

升温环境下肉鸡体温和呼吸频率对热中性区上限温度估测550-557

摘要：【目的】通过非线性分段回归模型,分析随环境温度逐渐升高,肉鸡体表、体核温度和呼吸频率开始升高时的环境温度,即拐点温度(IPT),估测肉鸡热中性区、热舒适区的上限温度。【方法】试验选择21日龄AA肉鸡10只,饲养于人工环境控制舱内。舱内温度由18℃开始,每0.5 h升高1℃,至33℃维持0.5 h后,逐渐降至20℃,循环3 d。利用微型温度记录仪连续监测肉鸡体表和体核温度(每10min记录1次)。【结果】经非线性分段回归分析,3次(天)估测出的肉鸡体表温度的拐点温度(IPTST)分别为21.18、21.09、21.13℃,平均21.13℃。肉鸡IPTST个体之间的变异较大,3次测定的变异系数分别为6.31、6.15、5.64;而同一只肉鸡3次估测的IPTST差别较小,10只鸡的变异系数平均为0.52,表明这种估测IPTST的方法重复性较好。肉鸡体核温度的拐点温度(IPTCT)3次测定的结果分别为27.80、27.98、27.67℃,平均27.82℃。个体之间IPTCT的变异系数为2.82、2.75、2.78,而同只肉鸡3次估测的IPTCT变异较小,平均变异系数为0.90,表明这种估测IPTCT的方法重复性较好。肉鸡呼吸频率的拐点温度(IPTRR)3次测定的结果分别为28.42、29.52、29.25℃,平均29.06℃。由于肉鸡在高温环境下喘息并非持续发生,本试验呼吸频率的测定时间过短(每个温度下每只鸡测定了1 min),造成部分肉鸡测定的呼吸频率过低,导致估测的IPTRR偏高。【结论】根据热中性区的定义,3—4周龄肉鸡热舒适区上限温度即为IPTST(21.13℃),而热中性区上限温度应低于IPTCT(27.82℃)。

家蚕IAP互作蛋白的筛选、鉴定及其对BmNPV增殖的影响558-567

摘要：【目的】细胞凋亡作为昆虫免疫应答的重要组成部分,在病毒与宿主相互作用的过程中扮演着重要角色,以细胞凋亡相关基因为研究对象对阐明其在病毒感染过程中的作用具有重要的参考价值。本研究旨在筛选家蚕凋亡抑制蛋白(Bombyx mori inhibitor of apoptosis protein,BmIAP)的相互作用蛋白,并验证其在家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)侵染过程中与Bmiap的相互调控关系及在BmNPV增殖过程中的作用,为探明宿主与BmNPV相互作用的分子机制提供理论依据。【方法】利用免疫共沉淀技术筛选在BmNPV侵染家蚕细胞过程中与BmIAP相互作用的蛋白,对获得的特异性差异条带进行LC-MS/MS蛋白质谱分析,根据蛋白分子量大小并利用生物信息学方法对获得的蛋白进行鉴定,确定候选基因;通过分子克隆技术对候选基因进行克隆,利用SMART在线工具及BioEdit分别对候选基因的结构域进行预测及多序列比对分析;通过免疫荧光试验验证BmIAP和候选蛋白的细胞共定位情况,并进一步利用免疫共沉淀验证它们的相互作用;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对候选基因进行过表达和敲除,利用qRT-PCR技术检测相应基因的表达情况,以确定Bmiap和Bmpp5在BmNPV侵染过程中的调控关系;同样,在过表达和敲除Bmpp5后检测杆状病毒Vp39的表达量,以确定Bmpp5对BmNPV增殖的影响。【结果】通过免疫共沉淀获得7个可能与BmIAP相互作用的宿主蛋白和1个BmNPV蛋白,进一步分析确定1个与凋亡相关的候选基因Bmpp5;Bmpp5的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸,预测的蛋白分子量约为56 kD,含3个TRP结构域和1个PP2Ac结构域,在昆虫间具有较高的保守性;免疫荧光检测证明BmIAP和BmPP5共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;在BmNPV侵染过程中,过表达Bmiap后,Bmpp5的表达量显著上调,而敲除Bmiap后,Bmp

中国农业科学杂志研究简报

不同来源中国李(Prunus salicina L.)的多样性与近缘种关系568-578

摘要：【目的】中国李资源丰富、分布广泛。更好地明晰不同来源中国李栽培品种的多样性、遗传结构差异以及与同域近缘种的关系,将有利于明确中国李驯化扩散历程以及近缘种在栽培驯化过程中的作用,促进中国李地方品种资源的深入挖掘和新品种的选育。【方法】利用均匀分布于基因组的22对SSR分子标记,采用荧光毛细管电泳检测技术对48份种质进行基因分型,其中包括38份不同来源的中国李种质、10份变异类型或近缘种。通过GenAlEx 6.41软件评估22对SSR引物的多态性,对参试种质按不同来源分析遗传多样性;利用NTSYS-pc 2.1软件构建48份材料的树状聚类分析图;并根据贝叶斯模型的Structure 2.2软件分析不同居群间的遗传结构差异。【结果】基于48份供试材料的数据,22对SSR引物等位变异范围为3—21个,平均每个位点检测到13.54个;总共检测到298个等位变异,其中有51.8%的等位变异属于稀有等位变异。在不同居群间进行比较,根据平均有效等位变异(Ne)、平均Shannon’s多样性指数(I)、观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)可以看出,南方品种群的多样性最高,其次为东北品种群;而杏李的多样性最低,且明显低于华北品种群。通过分子方差分析,认为中国李的多样性有69%的遗传变异来源于居群内,仅有31%的遗传变异来源于居群间。基于遗传分化系数和Nei’s遗传距离的数据比较,认为不同居群间存在显著的遗传分化,同时不同地理来源种质间存在适当的基因交流。树状聚类分析暗示国外育成品种与我国南方品种群具有较近的亲缘关系;而华北品种群与杏李关系密切;东北品种群与乌苏里李关系紧密。群体结构分析可以将栽培中国李种质资源划分为南方小果脆肉品种群、南方大果品种群(包括国外育成品种)、华北品种群和东北品种群。【结论】我国南方地区中国李的多样性最为丰富,�