兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定
摘要：【目的】培育抗玉米螟、抗草甘膦、抗旱的转基因复合性状玉米种质。【方法】通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化法,把重组到同一植物表达载体的cry1Ac M、epsps、GAT和Zm PIS转入玉米骨干自交系9801和齐319（Q319）,获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测和抗虫性鉴定,从大量转基因株系中优选出6个优良玉米株系。在此基础上,以非转基因自交系9801、Q319为对照,在严格控制条件下对6个转基因株系进行抗虫、抗除草剂和抗旱性检测。由于不同生长时期植株对玉米螟危害的敏感程度有差异,在抗虫性检测试验中,对不同生长阶段的转基因玉米的抗虫性,分别进行了田间和室内玉米螟接种试验,并以灌浆期玉米的籽粒和苞叶饲喂玉米螟幼虫检测其杀虫性。在草甘膦抗性鉴定试验中,对6叶期田间玉米植株喷洒大田除草用量的草甘膦溶液评估其应用价值;采用3倍应用剂量的草甘膦溶液喷施3叶期玉米植株测试其草甘膦耐受力。在抗旱性鉴定试验中,对10叶期玉米植株进行干旱胁迫处理,观测转基因植株的表型变化并测定光合作用和叶绿素荧光等参数。【结果】选择出6个遗传稳定的兼抗亚洲玉米螟、抗草甘膦和抗旱性提高的转基因玉米株系,其中株系L1—L3来自自交系9801,Q1—Q3来自自交系Q319。通过RT-PCR检测4个转基因的转录强度,证明它们在转基因植株中有效表达;利用Western blot方法检测cry1Ac蛋白的表达水平,确定其在玉米植株中稳定表达。植株抗虫性鉴定结果显示这6个株系在玉米营养生长期和灌浆期的抗虫能力均显著高于未转基因自交系。在草甘膦抗性测试中,转基因植株表现出明显高于未转基因自交系的草甘膦抗性。在干旱控水期间,转基因植株能维持较强的光合能力和光系统Ⅱ活性,对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。【结论】将cry1Ac M、epsps、GAT木质素与生物燃料生产：降低含量或解除束缚？
摘要：生物质能源作为可再生性替代能源之一,其开发利用可为解决当前全球变暖、化石能源成本飞涨和环境污染等重大问题提供新的途径。木质纤维素是植物细胞壁的主要组成成分,也是地球上最丰富的可再生资源之一,可转化为生物酒精等液体生物燃料。木质纤维素主要包括纤维素、半纤维素和木质素,三者之间由酯键、醚键和糖苷键等化学键连接,形成的木质素-糖类复合体是一种共价键聚合物,这些细胞壁成分的组成及其互作会影响多糖的水解作用,进而影响木质纤维素的转化利用效率,其中,木质素被认为是阻碍纤维素酶分解的主要物理障碍。当前,提高能源作物生物质的田间种植、生产效率及其工厂化降解、转化效率是生物质能源发展的热点和难点问题。由于木质素是木质纤维素生物量中除多糖之外含量最高的成分之一,提高木质素利用效率成为影响整个木质纤维素生物冶炼产能的关键。为此,文中从降低木质素含量和解除木质素束缚的角度出发,系统回顾了木质素在植物细胞壁中的发育沉积特征及其遗传改造研究进展,探究从植物细胞壁结构组成角度优化木质纤维素性状提高生物燃料产率的可能性,重点论述了降低能源植物木质素含量的遗传选育和基因改良策略,以及木质纤维素生物冶炼的预处理和分离技术。一方面,通过常规育种程序培育低木质素含量的生物能源作物品种,或是通过基因工程技术下调木质素的生物合成,对于提高木质纤维素利用效率和降低生物燃料生产成本均具有积极的作用。另一方面,以解除木质素束缚为目的的生物冶炼预处理技术是提高木质纤维素生物燃料工厂化生产效率的重要环节,主要包括酸预处理法、碱预处理法和有机溶剂预处理法,高效的预处理技术能够显著提高纤维素酶水解效率,增加生物酒精产量。文中最后对�外源四价硒条件下硫对小麦硒吸收的影响机制
摘要：【目的】研究硫肥对外源四价硒条件下土壤硒赋存形态和价态变化的影响,旨在揭示硫调控小麦硒吸收的作用机制。【方法】以郑麦9023为试验材料,通过苗期土培和水培进行,土培试验设3个硫水平,分别为0、150和300 mg·kg-1,硫源为硫磺,2个硒水平,分别为0和5 mg·kg-1,硒源为亚硒酸钠,生长至70 d收获并取土样;水培试验先将幼苗在1/5 Hogland-Arnon营养液中培养2周,然后开始进行处理,设3个硫水平,分别为0、1和2 mmol·L-1,硫源为硫酸镁,硒水平为10μmol·L-1,2种硒源,分别为亚硒酸钠和硒酸钠,培养24 h后收获,土培和水培试验均为完全交互设计,重复4次,采用HG-AFS-8220型双道原子荧光光度计对小麦地上部和根以及土壤中硒含量进行测定,根据与植物硒吸收的相关性,将土壤总硒分成不同赋存形态和价态。【结果】施用适量硒和硫对小麦生长均有一定的促进作用;150 mg·kg-1硫可以显著降低小麦地上部和根中硒含量和硒累积量,降幅分别可达61.7%、34.4%和55.7%、24.7%,但是这种降低不会随施硫量的增加而显著变化;施硫可以显著降低土壤p H值,最高可降低0.50个单位,并增加了土壤有机质含量,最高可增加0.78 g·kg-1。施硫可以显著降低土壤中水溶态硒含量,并显著增加铁锰氧化物结合态硒含量,也增加了有机结合态和残渣态硒含量,而对交换态硒含量无显著影响,表明施硫促使了硒在土壤中的钝化。施硫可以显著降低水溶态中各种价态硒含量,其降幅基本一致,施硫可以增加交换态中四价硒含量而显著减少六价硒含量,表明施硫抑制了硒在土壤中向高效价态的转化。小麦对四价硒和六价硒的吸收差异与是否施硫密切相关,无硫时,六价硒处理下小麦地上部和根中硒含量分别为四价硒处理的44.7和22.4倍,而硫浓度为1 mmol·L-1时,其硒含量迅速降为四价硒处理的2.8倍和51.8%,表明硫可以显著缩小小麦对海岛棉和陆地棉叶片光合特性、冠层结构及物质生产的差异
摘要：【目的】探讨海岛棉和陆地棉两个棉花栽培种群体物质生产存在差异的原因,揭示海岛棉和陆地棉产量形成的机理,为选育高光效棉花品种和高产高效栽培提供理论依据。【方法】在新疆气候生态条件下,选用能适应北疆棉区的海岛棉品种（系）（新海22号、H858）和陆地棉主栽品种（新陆早13号、新陆早33号）为试验材料,分别测定不同棉花品种（系）叶片的叶绿素含量、叶面积指数、冠层开度、叶片向日性运动、群体光合速率和生物量等指标,探讨海岛棉和陆地棉两个栽培种间群体冠层结构、叶片光合组分和光合生产特性等的差异。【结果】陆地棉品种冠层上部叶片数量多,叶面积指数大,冠层开度小,上部叶片光截获量占冠层光截获总量的比例大,冠层中下部光截获量少;海岛棉品种冠层上部叶片少,叶面积指数小,冠层开度大,截获的光占冠层光截获总量的比例小;海岛棉品种群体光合速率均比陆地棉高;两个棉花栽培种光合物质生产能力存在显著差异,海岛棉光合产物总量多,但生殖器官占总光合产物的比例显著低于陆地棉;海岛棉和陆地棉产量构成因子及皮棉产量差异显著,陆地棉单位面积总铃数约为1.30×106个/hm2,皮棉产量为3 000—3 500 kg·hm-2,海岛棉虽然单位面积铃数显著大于陆地棉,达到1.54×106个/hm2左右,但单铃重远低于陆地棉,皮棉产量仅1 500 kg·hm-2左右;在棉铃空间分布上,海岛棉棉铃主要分布在冠层中下部,而陆地棉棉铃在冠层中上部的分布比例大。【结论】与海岛棉相比,陆地棉总光合产物低,但经济系数高,籽棉产量高,通过改善陆地棉冠层结构,延长群体光合功能期,提高光合产物累积量,有利于陆地棉产量的进一步提高;与陆地棉相比,海岛棉冠层光能利用率高,群体光合速率高,光合物质生产潜力大,但单铃重低,总铃库较小,且铃库与光合源比例失衡PVY^NTN-NW榆林分离物的全基因组序列测定与分析
摘要：【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是马铃薯病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）代表成员,是马铃薯和烟草生产中分布最为广泛并造成严重经济损失的病毒之一。研究旨在揭示PVY榆林分离物ShX14的全基因组特征,并准确判断其株系分子类型。【方法】根据已经报道的PVY不同基因保守区设计11对简并引物,采用片段重叠法从感染PVY的马铃薯病叶中扩增、克隆获得榆林分离物ShX14的全长序列,并对其序列特征、重组位点、系统发育关系等进行分析。同时,应用系统发育与性状关联分析（phylogeny-trait association analysis）评估PVY分离物与株系的关联性。【结果】测序获得的ShX14分离物核苷酸序列全长为9 724 nt（不含3′端的多聚腺苷酸尾）。该病毒基因组含有一个9 186 nt的开放阅读框,编码3 061个氨基酸的多聚蛋白（polyprotein）。在P3顺反子中＋2相位上也发现由移码（reading frame shift）产生的PIPO蛋白。全基因组序列比较分析显示,ShX14分离物与HN2、SYR-NB-16分离物（PVYNTN-NW株系SYR-I型）的核苷酸、氨基酸序列的一致性分别为98%—99%和98%—100%。该分离物的P1、HC-Pro/P3和CP基因的5′端均检测到显著的重组信号,重组位点分别位于2 318、5 674和8 385 nt,与PVYNTN-NW株系（SYR-I型）的重组位点相似。系统发育分析结果显示该分离物与HN2、SYR-NB-16分离物相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVYNTN-NW株系（SYR-I型）的亲缘关系最近。系统发育分析与性状关联分析结果显示该分离物与PVYNTN-NW株系（SYR-I型）的关联系数（association index,AI）、简约分值（parsimony score,PS）和最大单系分支（maximum monophyletic clade,MC）3个统计检验均显著,表明其与PVYNTN-NW株系（SYR-I型）存在显著的关联性。同时,应用多重RT-PCR成功扩增出约为1 000、600和400 bp的3个特异性片段,与PVYNTN-NW株系（SYR-I型）的正交设计和均匀设计在优化噻虫胺悬浮剂物理稳定性上的应用
摘要：【目的】比较正交和均匀设计两种多因素试验方法在水悬浮剂配方中应用的优缺点,为该方法在农药制剂学领域的应用提供参考。【方法】在采用流点法初筛得到润湿性能良好的润湿分散剂之后,分别采用正交设计和均匀设计制备30%噻虫胺悬浮剂。综合考察润湿分散剂和黏度调节剂对制剂热贮析水率、离心沉淀率、黏度、流动性、分散性、热贮前后样品的粒度分布（D10、D50和D90）和悬浮率的影响。通过主效应图分析正交试验结果,采用逐步回归和偏最小二乘法（PLS）分析均匀试验结果,最后检验优化配方的各项性能。【结果】正交试验和均匀试验的所有样品黏度均在144.50—317.84 m Pa·s,均具有良好（良级或优级）的流动性和分散性。由于奥氏熟化作用,样品经热贮后,粒子的粒径轻微增大,D10、D50和D90分别由0.56—1.00、0.88—1.53和1.77—2.68μm变为0.76—1.02、1.12—1.56和2.07—3.25μm。所有样品贮前悬浮率均在91.88%—96.39%,经热贮后样品的悬浮率变化不大,分别在91.91%—96.13%,符合悬浮剂质量控制的一般要求,故本研究主要优化了热贮析水率和离心沉淀率两个指标。正交试验分析结果表明,T2700、黄原胶和硅酸镁铝的用量对热贮析水率和离心沉淀率均有显著影响,且均随用量增加而降低,而NR1601的用量对两个因变量的影响不显著。采用正交设计优化的配方,样品黏度为229.6 m Pa·s,流动性和分散性良好,热贮前后悬浮率分别为（94.76±0.70）%和（93.50±0.20）%,热贮析水率为（4.23±0.19）%,离心沉淀率也低于10%。均匀设计中,PLS平方项模型对热贮析水率有良好的预测性,热贮析水率为（2.55±0.03）%,离心沉淀率也仅为（4.36±0.21）%,优化样品的黏度为324.16 m Pa·s,流动性和分散性良好,热贮前后悬浮率分别为（93.19±0.09）%和（92.77±0.22）%,粒子的粒径小且分布较窄。PLS线性模型对离�秸秆还田对长期连作棉田土壤腐殖质组分含量的影响
摘要：【目的】以棉花长期连作定位试验田为研究对象,分析秸秆还田条件下长期连作棉田土壤腐殖质组分含量变化特征,为衡量和评价秸秆还田对长期连作棉田土壤质量和肥力的影响提供科学的理论依据。【方法】试验在石河子大学农学院试验站棉花长期连作定位试验田进行。设秸秆还田模式下5、10、15、20、25和30 a棉田连作小区,无秸秆还田模式下1、5、10和15 a连作小区,共计10个处理,每个处理3次重复,小区土壤初始背景值相近。棉花种植品种为＂新陆早46号＂,按＂30＋60＋30＂宽窄行距配置,种植密度为每公顷19.8万株/hm2。全生育期滴灌11次,滴灌总量5 400 m3·hm-2,采用膜下滴灌。共施纯氮495 kg·hm-2,30%基施,其余随水滴施,其他管理措施同一般大田管理。【结果】秸秆还田可以显著提高3个土层土壤胡敏酸含量,随着连作年限增加,胡敏酸含量逐渐升高,20—40 cm土层土壤胡敏酸积累幅度最大,连作30 a棉田土壤胡敏酸含量比连作5、10、15、20和25 a分别增加139.90%、86.68%、93.33%、58.60%和22.86%;秸秆还田长期连作棉田0—20、20—40和40—60 cm土层土壤富里酸含量随着连作年限的增加而保持稳定不变,分别维持在（2.79±0.19）、（2.56±0.10）和（1.77±0.15）g·kg-1的水平上,而且0—20 cm和20—40 cm土层富里酸含量明显大于40—60 cm土层。秸秆还田能够显著地增加长期连作棉田各个土层胡敏素含量,胡敏素含量0—20〉20—40〉40—60 cm土层。秸秆还田不同连作年限CHA/CFA值均大于1,PQ值均大于0.5,且随着年限增加而增大,连作5 a最小,连作30 a最大,0—20、20—40和40—60cm土层连作30年CHA/CFA比连作5 a分别增加120.04%、116.39%和112.91%,PQ值连作30 a比连作5 a分别增加37.15%、36.44%和36.81%。【结论】秸秆还田能够提高长期连作棉田土壤胡敏酸和胡敏素的含量,增加富里酸含量并使之处于稳定水平上,还能够显著沙漠绿洲灌区甜瓜氮磷钾用量优化模式研究
摘要：【目的】为优质甜瓜生产提供科学施肥依据,以挖掘产量潜能,降低生产成本,防止过量施肥造成的环境污染。【方法】连续两年田间试验按氮、磷、钾3因子5水平312-D饱和最优设计方法进行,建立以甜瓜收获后产量、可溶性固形物含量（SSC）和经济效益为目标的肥料效应方程,解析肥料的独立效应与交互效应,确定甜瓜氮磷钾施用量阈值。【结果】相对于不施肥处理（N0P0K0）,施肥后甜瓜产量提高了16.42%—65.98%,SSC提高了6.71（2012年）和6.62（2013年）个百分点;在其他两个施肥因子一致时,施氮量由0增加到360 kg·hm-2,产量分别提高31.23%（2012年）和31.47%（2013年）,SSC增加2.89（2012年）和2.46（2013年）个百分点;施磷量由0增加到180 kg·hm-2,产量提高5.77%（2012年）和7.53%（2013年）,SSC提高0.55（2012年）和1.09（2013年）个百分点;施钾量由0增加到90 kg·hm-2时,产量提高5.51%（2012年）和5.09%（2013年）,SSC提高1.37（2012年）和1.69（2013年）个百分点。甜瓜产量、SSC和经济效益随着氮、磷、钾用量的增加而先增加、后降低。对甜瓜产量、SSC和经济效益影响顺序为氮〉钾〉磷。氮磷、氮钾互作对产量、SSC和经济效益影响较为明显,而磷钾互作的影响均不显著;氮磷互作对产量和经济效益为正效应,对SSC不显著;氮钾互作对产量和经济效益为负效应;磷、钾肥含量较低时,增施氮肥对产量、SSC形成抑制作用,较高时氮肥有明显的增效作用。【结论】综合考虑氮磷钾肥对产量、品质和经济效益的影响,绿洲灌区大田甜瓜高产优质高效益的施肥方案为：施氮量260.22—263.64 kg·hm-2,施磷量133.03—134.08 kg·hm-2,施钾量87.53—88.52 kg·hm-2,产量为44 356kg·hm-2,SSC 13.61%,经济效益68 445 yuan/hm2。水肥耦合对温室袋培番茄品质、产量及水分利用效率的影响
摘要：【目的】探讨水分和肥料与温室袋培番茄品质、产量及水分利用效率关系,为温室袋培番茄的高效生产提供科学依据。【方法】在温室条件下,以番茄品种‘金棚1号’为试材,研究水肥耦合对温室袋培番茄品质、产量和水分利用效率的影响,同时基于主成分分析方法对番茄品质做多目标综合评价,最后分析不同处理番茄生产的成本和经济收益。【结果】单株施肥量、灌水量以及水肥交互作用对番茄各品质指标影响不同。在相同水分条件下,番茄果实中硝酸盐和可溶性蛋白含量随着肥料浓度的升高而增加,而Vc、番茄红素以及可溶性糖含量却呈现先增加后减少的趋势;在相同肥料浓度下,随着基质含水量的增加番茄果实中硝酸盐、Vc、可溶性蛋白、以及可溶性糖等含量逐渐降低,表现为＂稀释效应＂,番茄红素的含量则在中水处理下较高;在单株施肥量一定的条件下,其产量随着灌水量的增加呈现先增加后降低的趋势,而在单株灌水量一定的条件下,产量随着施肥量的增加同样呈现抛物线趋势,施肥量、灌水量以及水肥交互作用对番茄产量的影响都达到了极显著水平,其影响大小顺序为水分作用〉肥料作用〉水肥交互作用;在同一施肥水平下,袋式栽培番茄灌溉水分利用效率随着单株灌水量的升高而降低,在同一灌水量水平下,灌溉水分利用效率随着施肥量的增加呈抛物线趋势,施肥量和灌水量作为单一因子对灌溉水分利用效率的影响极显著,且水分作用〉肥料作用,而水肥交互作用对水分利用效率的影响不显著;高肥高水处理的净收益最高,为4.98元/株,与中肥中水处理（4.86元/株）、高肥中水（4.84元/株）以及中肥高水（4.80元/株）之间无显著性差异;而低肥低水处理的净收益为3.33元/株,显著低于其他处理。【结论】综合考虑品质、产量、水分利用效率、资源节约以弱光下菊花‘清露’的激素水平及相关基因表达
摘要：【目的】测量菊花在弱光条件下,出现庇荫症状过程中乙烯生成速率、赤霉素和生长素含量的变化及相关基因表达变化,从激素和基因水平探究庇荫机理。【方法】以菊花‘清露’为试验材料,设置55%光照（对照）和15%光照（弱光处理）。利用气相色谱仪Agilent 6890N GC在0、2、4、6和8 d测量乙烯生成速率,利用高效液相色谱仪Agilent HPLC-110在0、2、4、6和8 d测量赤霉素（GA3）和生长素（IAA）含量,以GAPDH为内参基因用荧光定量PCR方法测量0、2、4、6和8 d时PHYA、COP1、PIF4、GAI和IAA1的相对表达量。设置0.5、1.0、2.0和4.0 mmol·L-14个GA3浓度,用适量乙醇溶解,使乙醇终浓度为1%,0 d、4 d时各处理1次,采用地上部喷施;设10、20、50和100μmol·L-14个多效唑（paclobutrazol,PAC）浓度,用适量乙醇溶解,使乙醇终浓度是1%,0 d和4 d时各处理1次,根据结果以2.0 mmol·L-1GA3,50μmol·L-1PAC对植物生长影响显著,分别作为处理浓度。0 d、7 d各喷1次,14 d时取样进行基因表达分析。【结果】15%光照条件下,第2天和第4天时乙烯生成速率显著增加,第4天最显著,比对照增加了2.04倍,第6天以后对照和处理的植株乙烯生成速率差异不显著,15%弱光处理条件下植株地上部乙烯生成速率比55%光照条件增加显著;15%光照条件下,第2、4和6天时叶片赤霉素含量与对照相比显著增加,第6天时出现峰值,达到4 700.56 ng·g-1,比对照高出2.57倍,随后又迅速下降,第8天降到与对照相同的水平;15%光照条件下生长素水平与对照组相比显著下降,随着处理时间的延长,对照组生长素含量呈增加趋势,弱光处理组生长素含量呈下降趋势,第8天时处理组生长素含量为223.95 ng·g-1FW,对照为489.77 ng·g-1FW,对照比处理的生长素含量高出1.12倍。弱光处理第2天时PHYA表达量迅速增加,2—6 d以略小的速度增加,6—8 d保持不变,对照组从第2天开始下降,4—8 d时处理组P大蒜蔗糖﹕蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST）的酶学特征
摘要：【目的】研究大蒜（Allium sativum L.）中蔗糖﹕蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST）的酶学特征,为大蒜保鲜、加工和品质改良提供依据。【方法】采用饱和度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的硫酸铵分级沉淀1-SST,以确定其所在的硫酸铵部位。分别取1-SST活力最高的硫酸铵部分与底物蔗糖反应,研究其在不同的温度、pH、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖的能力,即采用高效液相色谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD）,测定1-SST反应前后的1-蔗果三糖的含量,进而计算出1-SST活力大小并总结出其在不同的温度、pH、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖反应的规律;采用的色谱柱为Prevail CarbohydrateES柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,色谱柱柱温箱温度为40℃,流动相最大限压20 MP,流动相为乙腈和水,其流速为1.0 mL.min-1,ELSD撞击器关闭状态,漂移管温度90℃,载气流量2.5 L.min-1（空气）。其梯度洗脱方式为：0 min,75%乙腈﹕25%水;15 min,65%乙腈﹕35%水;30 min,50%乙腈﹕50%水;35 min,75%乙腈﹕25%水;40 min,75%乙腈﹕25%水。【结果】在上述测定条件下,果糖、葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖6种糖完全分离,出峰时间仅为20 min,测定方法可靠、灵敏度高,满足了测定1-SST活性的要求。以50%（w/w）蔗糖为底物时,仅产生1-蔗果三糖,无其它高果聚糖的产生,证实了在所试条件下,大蒜中1-SST反应具有专一性。大蒜1-SST主要存在于30%—40%硫酸铵饱和度部分,其中0—30%,40%—70%有轻微活力,未发现70%—100%硫酸铵组分有1-SST的活力。取30%—40%的硫酸铵饱和度部分作为样品研究1-SST酶学特征发现其最适反应温度为35℃,当温度到达40℃以上时,酶的活力下降的很快,说明1-SST具有热不稳定性,因此在研究大蒜1-SST时,要尽量避免高温,以免影响后续研究;其最适反应pH为5.0,与大麦（Hordeum vulgare）大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析
摘要：【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2（pleckstrin homology-like domain,family A,member 2）基因序列,分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系,为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪PHLDA2的保守区域设计引物以RT-PCR方法扩增大足黑山羊该基因部分c DNA序列,进一步利用5′-和3′-RACE技术获得全长c DNA序列;利用ORF Finder和Prot Param等在线工具分析PHLDA2基因序列特征;采用Real-time PCR方法分析PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10个组织的表达差异;寻找大足黑山羊和波尔山羊PHLDA2基因序列SNP位点,基于表达SNP的方法分析该基因在F1代组织中的印记状况;采用线性回归的方法分析PHLDA2表达量与胎盘性状的关系。【结果】①克隆得到935 bp大足黑山羊PHLDA2的c DNA全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR和编码序列分别为62 bp、450 bp和420 bp,其编码140个氨基酸。②预测的山羊PHLDA2蛋白分子量大小为15 638.7 Da,等电点为9.18,二级结构由α-螺旋（37.14%）、β-转角（9.29%）、延伸链（23.57%）和无规卷曲（30%）组成,并且包含保守的PH（pleckstrin homology）结构域。3BLAST分析发现,山羊PHLDA2定位于29号染色体,其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性分别达到91%,90%,90%,90%和89%,在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。4荧光定量PCR结果显示PHLDA2在山羊胎盘中表达量最高（P〈0.01）,在心、肝、肺、肾、肌肉、脂肪、舌和大脑组织中表达量很低且差异不显著（P〉0.05）,在脾中未检测到表达。5印记分析表明,PHLDA2在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表达母源等位基因,但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。6PHLDA2表达水平与山羊胎盘重回归关系显著（n=15,R2=0.855,P〈0.01）。【结论】山羊PHLDA2基因序列和结构特�猪传染性胃肠炎病毒非结构蛋白3a和3b融合表达及对细胞周期的影响
摘要：【目的】克隆及真核表达猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）陕西分离株的3a和3b基因,研究表达蛋白在细胞中的分布及其对细胞周期的影响。【方法】利用软件Primer 5.0参照Genbank公布的序列设计两对分别针对TGEV非结构蛋白基因3a和3b的特异性引物。采用RT-PCR方法从TGEV陕西分离株克隆3a和3b基因,再将其与真核表达载体p EGFP-N1连接,构建真核表达质粒p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂质体转染法将重组质粒转染猪小肠黏膜上皮细胞（intestinal epithelial cells,IEC）,采用激光共聚焦显微镜检测转染细胞内融合蛋白的表达分布情况。通过RT-PCR检测细胞中目的基因的转录情况,Western blotting检测细胞中融合蛋白的表达情况。利用流式细胞仪检测表达蛋白对细胞周期的影响,采用实时荧光定量PCR检测融合蛋白的表达对内质网应激蛋白标志性分子GRP78和细胞周期蛋白Cyclin A的表达的影响,通过Western blotting试验检测细胞中蛋白表达后GRP78、Cyclin A和Cyclin B1表达量的变化情况。【结果】成功克隆出完整的TGEV陕西分离株的3a及3b基因,经过测序鉴定,3a基因的大小为213bp,3b基因的大小为732bp;经过与不同来源的TGEV毒株进行对比分析,3a基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为97.4%—100%,氨基酸同源性为98.6%—100%;3b基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为98.3%—99.9%,氨基酸同源性为100%。重组表达载体转染IEC细胞后,经Western blotting分析IEC分别表达出分子质量约为35k D的3a-GFP和54k D的3b-GFP的融合蛋白,与预期结果相一致。激光共聚焦显微镜观察到融合蛋白3a-GFP和3b-GFP在IEC细胞的细胞核和细胞质中均有表达,流式细胞仪分析TGEV非结构蛋白3b的表达能够使G2/M期的细胞增多,实时荧光定量PCR分析显示细胞周期蛋白Cyclin A的m RNA水平高于对照组细胞（IEC和IEC-GFP）,同时Western blotting分析结�基于1H NMR技术的乳热奶牛血清代谢组学分析
摘要：【目的】应用1H谱核磁共振（1H NMR）技术筛选乳热奶牛血清内差异表现的小分子代谢物,从小分子水平和物质、能量代谢的角度探究奶牛发生乳热时其体内的代谢变化。【方法】选取年龄、胎次、体况和泌乳量相近的分娩当天的荷斯坦高产奶牛共32头,根据其血清中钙离子浓度及其有无临床症状分为两组。其中,24头奶牛为健康对照组（Group1,血钙浓度〉2.5 mmol·L-1,无其他任何症状）和8头乳热组（Group2,血钙浓度〈1.4mmol·L-1,伴有明显乳热临床症状）。32头奶牛分别于清晨饲喂和榨乳前从颈静脉采集血液10 m L,置于离心管中,4℃下以1 500×g离心20 min,将离心得到的血清装入1.5 m L的EP管中,置于-80℃下待测。待样品解冻后,分别从每个EP管中抽取400μL血清,加入200μL缓冲盐溶液,充分混合、离心后,提取550μL上清液置于5mm核磁管中,在500 MHz的核磁共振波谱仪下采集信号。然后利用Topspin和Mest Re Nova等软件将采集到的信号进行傅里叶转换,同时进行调零、校正基线和相位等预处理,去除水峰和尿素峰信号,将一维图谱进行积分分段,并将图谱信息转换为TXT格式文件,以便于后续数据分析,然后使用Chenomx软件进行化合物指认。最后应用SIMCA-P软件对得到的图谱数据进行多元统计分析,包括主成分分析（PCA）和正交修正-偏最小二乘法-判别分析（OSC-PLS-DA）,同时结合SPSS软件对核磁数据进行单因素方差分析得到的P值以及Loading图,最终筛选出表现差异的小分子代谢物。【结果】本试验成功得到了乳热组和健康对照组奶牛的血清代谢图谱及差异表达代谢物的Loading图;PCA结果显示每组样品均在95%置信区间内,无需剔除,主成分贡献率较低,其中PC1=26.2%,PC2=16.7%,组间差异变量不能被选择;OSC-PLS-DA结果显示经过5次正交信号修正,与分组无关的变量被去除,组间差异达到最大化;与健康对照组相�基于gpd基因的大蒜黑腐病菌实时荧光定量PCR鉴定技术
摘要：【目的】大蒜黑腐病菌（Embellisia allii（Campanile）Simmons）的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长,而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似,极难分辨,需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,q PCR）体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从NCBI的Gen Bank数据库中,选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的3-磷酸甘油脱氢酶（gpd）基因核酸序列数据15种,应用引物设计软件Primer express,根据探针设计原则从理论上选出1条探针和3对引物。根据试验结果对上述引物进行筛选,筛选出能够鉴定出大蒜黑腐病菌的特异性引物对和Taq Man探针。同时对反应体系中复性-延伸温度的反应参数进行优化,设计56、58、60℃3个温度梯度;将大蒜黑腐病菌基因组DNA在紫外核酸分析仪上进行定量后进行10倍的梯度稀释,对探针灵敏性进行测试,从而建立大蒜黑腐病菌Taq Man水解探针法q PCR检测体系。【结果】从基于Gen Bank上的15种gpd基因核酸序列设计的引物和探针中,筛选出能够鉴定大蒜黑腐病菌的特异性引物对Emb21/Emb32和Taq Man探针Emb。在供试的6种菌株中,只有靶标菌大蒜黑腐病菌利用该引物对和探针能够被特异性的检测到阳性,空白对照和其他参试菌均没有荧光信号的增加,检测为阴性。复性-延伸温度反应参数优化中,△Rn荧光信号增加值在58℃时达最大,56、60℃荧光信号增加值降低,经过多次重复试验,确定最佳的复性-延伸温度为58℃。灵敏度测试中,大蒜黑腐病菌DNA浓度稀释到140 pg时,所得的图形较好;当体系中模板浓度稀释到14 pg时,所得的图形较差。最终DNA检测灵敏度为140 pg。应用该引物和探针建立的q PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出大蒜黑腐病菌。【结论】建立了大蒜�基于基因组原位杂交快速构建黄瓜变种间核型
摘要：【目的】利用基因组荧光原位杂交（genomic in situ hybridization,GISH）技术,对黄瓜（Cucumis sativus L.,2n=2x=14）种内两个变种（栽培黄瓜C.sativus var.sativus和野生黄瓜C.sativus var hardwickii）进行中期染色体分析,建立黄瓜变种染色体核型的快速分析方法,为黄瓜细胞分子遗传学研究提供基础。【方法】以栽培黄瓜‘9930’和野生黄瓜C.sativus var.hardwickii为材料,利用CTAB法提取栽培黄瓜‘9930’的基因组总DNA,采用缺刻平移法,将栽培黄瓜‘9930’基因组DNA和45S r DNA分别利用地高辛和生物素标记为探针,与栽培黄瓜‘9930’和野生变种C.sativus var.hardwickii的中期染色体进行荧光原位杂交,根据杂交结果显示的栽培黄瓜与野生变种每条染色体GISH荧光带型的不同,结合45S r DNA位点信号特征,区分栽培黄瓜与野生变种的每条染色体,并进行核型分析。【结果】荧光原位杂交结果显示,GISH信号并非平均分布于所有染色体上,而是在不同染色体的特定部位产生独特的信号,且两个变种间中期染色体的GISH信号模式差异显著。在栽培黄瓜‘9930’有丝分裂中期染色体上,除了6号染色体仅在短臂末端和近着丝粒处产生GISH信号外,其他染色体上的GISH信号集中分布于染色体的两端和近着丝粒的一侧或两侧,且每条染色体的信号特征差异明显;45S r DNA信号主要分布于‘9930’的第1、2、3、4和7号染色体的近着丝粒处,有3对强信号和2对弱信号。在野生黄瓜C.sativus var.hardwickii有丝分裂中期染色体上,杂交信号的位置及强弱与栽培黄瓜‘9930’表现明显不同,近着丝粒处均有GISH信号,但仅在第1、2、4和5号染色体的一端产生GISH信号,45S r DNA信号仅出现在第1、2和3号染色体上,表现为第1号染色体上信号极强,第2和3号染色体上信号极微弱。这些结果显示,以栽培黄瓜基因组DNA为探针的荧光原位杂交能反应出两个变种中�
