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摘要:【目的】构建小麦EMS突变体库,为小麦功能基因组学研究准备基础材料。【方法】利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)诱变处理小麦品种偃展4110种子,将获得的M2代材料进行生物学性状与农艺性状鉴定,部分M3材料播种家系进行验证。【结果】对M2代全生育期田间表型进行观察鉴定,突变群体的表型变异率约为6.6%;获得了幼苗、叶、茎、穗及成熟期等生物学特性与主要农艺性状的变异体和突变体,变异类型丰富,特别是发现了自然突变中少见的变异类型,如株高在10-15cm左右的特矮变异类型。【结论】本研究所构建的两个偃展4110EMS突变群体较为理想,可望有效地被用于小麦功能基因组研究和小麦遗传改良中。
摘要:2008年是转基因作物商品化生产的第13年。据国际农业生物技术应用服务组织(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA)报告,该年度全球新增转基因作物种植国3家,分别是非洲的布基纳法索和埃及,以及拉丁美洲安第斯山脉地区的玻利维亚。这3国的加入使得全球转基因作物商品化种植国家总数达到25。其中,种植面积不少于10万公顷的国家有14家,种植面积从多到少依次是:美国(6250万公顷)、阿根廷(2100万公顷)、巴西(1580万公顷)、印度(760万公顷)、加拿大(760万公顷)、中国(380万公顷)、巴拉圭(270万公顷)、南非(180万公顷)、乌拉圭(70万公顷)、玻利维亚(60万公顷)、菲律宾(40万公顷)、澳大利亚(20万公顷)、墨西哥(10万公顷)和西班牙(10万公顷)。智利、哥伦比亚、洪都拉斯、布基纳法索、捷克、罗马尼亚、葡萄牙、德国、波兰、斯洛伐克和埃及种植面积不到10万公顷。
摘要:【目的】通过对籽粒淀粉积累和淀粉合成关键酶的活性进行比较,初步明确不同Wx蛋白组成小麦品种淀粉理化特性差异的酶学基础。【方法】以6类Wx蛋白组成的14个小麦品种为试材,测定其籽粒灌浆过程中直、支链淀粉积累动态和4种淀粉合成关键酶的活性变化,对测定结果进行统计分析。【结果】Wx蛋白数目和类型对4种淀粉合成关键酶活性和直、支链淀粉合成有明显影响。随着Wx蛋白数目的增多,4种淀粉合成关键酶活性呈现升高的趋势,尤其是淀粉粒束缚淀粉合成酶(GBSS),籽粒直链淀粉含量也相应升高。Wx-B1缺失蛋白对GBSS活性影响最大,直链淀粉合成能力下降最明显,其次是缺失Wx-D1蛋白,Wx-A1蛋白缺失作用最小。籽粒灌浆过程中,4种淀粉合成关键酶活性高度相关,并与直、支链淀粉含量密切相关,说明直、支链淀粉的合成是相互影响、相互制约、同步进行的。【结论】Wx基因是影响籽粒直链淀粉含量的重要决定因素,Wx基因可以通过自身数目和组成的变化,控制GBSS的活性,并对其它淀粉合成关键酶的活性产生影响,最终影响直、支链淀粉的合成,形成不同的淀粉理化特性和加工品质。
摘要:【目的】二维液相色谱(2D-LC)与双向电泳(2-DE)技术具有互补性,本文旨在探讨利用2D-LC和纳升级液相色谱串联质谱(Nano LC-MS/MS)技术分离鉴定小麦叶片蛋白质组的新方法。【方法】小麦叶片蛋白经提取、脱盐后,进行第一维阴离子交换分离;收集洗脱组分进行SDS-PAGE分析,并对非高丰度蛋白组分进行第二维反相液相色谱分离;随机选择含较低吸收峰的部分组分经胰蛋白酶水解后进行Nano LC-MS/MS分析;将串联质谱数据通过MASCOT搜索NCBInr和EST数据库,并对二级质谱获得的蛋白序列进行MSBLAST分析。【结果】经第一维阴离子交换色谱分离,收集得到15个组分,其中第15组分包含小麦叶片丰度最高的蛋白——1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO);其余14个组分经反相液相色谱分离,共收集1551个组分,获得1867个色谱峰;随机对其中6个含较低吸收峰的收集组分酶解和Nano LC-MS/MS检测,9种蛋白得到鉴定。【结论】结果初步表明,利用2D-LC和Nano LC-MS/MS技术可有效地分离和鉴定小麦叶片蛋白质组,为更深入全面地研究小麦叶片蛋白质组奠定基础。
摘要:【目的】为提高中国玉米育种技术水平而探索突破方向和寻找理论依据,对不同年代玉米杂交种的产量与年代的回归进行研究。【方法】试验于2005-2006年在新疆省农业科学院科研基地和北京顺义屯玉公司北京研究院进行。采用裂区试验设计,3个密度为主区,华北地区近40年有代表性的23个单杂交种为副区。【结果】新疆点1980s-2000s中密度下的产量年代响应〉高密度,北京点1980s-2000s中密度下的产量年代响应与高密度下的差异不显著,表明1980s年代以后中国华北地区玉米杂交种在每公顷60000株的密度水平上没有实现更高的产量年代响应;1980s-2000s产量显著提高主要是由于千粒重、穗行数的正向改良,而秃尖度、出籽率的消极改良同时又限制了1980s-2000s年代玉米产量的提高;此外,空秆率、茎倒折率、根倒伏率、秃尖度等性状在1980s-2000s间没有得到显著改良。【结论】1980s-2000s期间中国玉米杂交种在高密度条件下玉米产量的年代响应取得了一定的进展,但与国外还有相当大的差距,今后的玉米育种应强化和完善高密度育种技术路线,使未来中国玉米单交种向依靠群体增产的早熟、耐密、出籽率高、秃顶度小的育种目标方向发展。
摘要:【目的】利用棉花无短绒突变体GZnn为材料,分离与棉花纤维发育相关的重要基因,从而揭示棉花纤维发育的分子机理。【方法】通过扫描电镜观察GZnn与其近等基因系TM-1在纤维发育上的差别;采用差异显示RT-PCR方法寻找GZnn与TM-1之间的差异表达片段,并进行相应分析。【结果】用扫描电镜观察突变体GZnn与TM-1的胚珠表面纤维细胞起始发生的情况,发现GZnn不仅在纤维细胞发生和延伸上延迟,而且纤维细胞总数也明显减少。利用差异显示PCR进行比较筛选,获得了12个差异表达的EST片段,其中,DS3只特异性地在GZnn开花前(-3~0DPA)的胚珠中特异表达,而在其近等基因系TM-1中没有表达,推测DS3可能是一个纤维启动过程中的MYB类负调控转录因子。【结论】本研究利用棉花无短绒突变体GZnn发现,棉纤维细胞在早期分化和形态建成过程中大量基因表达,对其中的关键基因的表达模式和功能开展深入研究将有助于阐明棉纤维分化发育的分子机理,为棉花遗传改良提供理论基础。
摘要:【目的】甘薯对人体有较强的保健作用,特别是富含胡萝卜素的品种保健价值更高。采用分子标记和农艺性状相结合评价亲本亲缘关系,可提高甘薯高胡萝卜素食用品种的选育效果。【方法】评价15个亲本及其集团杂交后代的农艺性状、品质性状,结合RAPD、ISSR分子标记,进行聚类分析,筛选亲本。【结果】亲本间胡萝卜素含量和鲜薯产量两个重要性状的变异范围较大。胡萝卜素含量与鲜薯产量和薯干产量均呈负相关。可溶性糖、蛋白质、胡萝卜素含量几个重要的品质性状之间未发现不利相关现象。亲子代间胡萝卜素含量呈极显著正相关,相关系数为0.7932**。基于农艺性状分析供试材料亲缘关系与已知系谱不吻合,基于分子标记聚类分析结果与已知系谱吻合度较高;ISSR标记每条引物平均扩增条带13.8条,多态性条带比率为89.86%,RAPD标记每条引物平均扩增条带9.4条,多态性条带比率为74.46%。【结论】甘薯常用亲本胡萝卜素含量遗传背景丰富;利用分子标记分析亲本亲缘关系比农艺性状客观;ISSR标记比RAPD标记分析效率高;结合分子标记和农艺性状,可为甘薯高胡萝卜素食用品种选育亲本组配提供一定的理论依据。
摘要:【目的】研究光敏核不育水稻花药发育过程中Ca2+分布与花粉败育的关系。【方法】采用焦锑酸钾沉淀法,研究光敏核不育水稻农垦58S和可育品种农垦58N花药发育过程中药隔、药壁和花粉细胞中Ca2+的分布变化。【结果】不育花药与可育花药中Ca2+分布有很多差异:(1)可育花粉细胞表面逐渐积累丰富的Ca2+沉淀,花粉壁发育完全,细胞质中Ca2+很少;而不育花粉细胞表面Ca2+较少,花粉壁形成异常,细胞质中积累丰富的Ca2+沉淀。(2)不育花药绒毡层提前启动解体,且解体过程十分缓慢;不育花药较可育花药提前形成乌氏体,但其表面无Ca2+沉淀直至单核晚期才有明显分布,且数量少于同期可育花药。总体上看,除乌氏体以外,不育花药各壁层细胞中的Ca2+沉淀多于可育花药。(3)花药发育过程中,药隔组织中的Ca2+沉淀逐渐增多,同期相比,不育花药多于可育花药。【结论】光敏核不育水稻绒毡层细胞提早解体及乌氏体功能异常,导致Ca2+向药室的运输发生障碍,致使花粉表面缺乏Ca2+而引起花粉外壁形成不正常;花粉发育后期细胞质内积累大量Ca2+是花粉败育的主要因素之一。
摘要:【目的】以2个不同品质类型的小麦品种为供试材料,分析小麦胚乳中淀粉粒的分布特征和变化特点。【方法】选用鲁麦21(弱筋)和济南17(强筋)两个小麦品种,利用激光衍射粒度分析仪研究其胚乳发育过程中淀粉粒的积累动态。【结果】花后不同时期小麦胚乳淀粉粒数目的变化均呈单峰曲线,峰值出现在0.5~1.1μm。花后7d,A-型淀粉粒已经出现,最大直径20μm;花后10d,淀粉粒直径范围扩大到30μm;至花后14d,B-型淀粉粒开始产生;花后21d又产生了一个新淀粉粒群体,即C-型淀粉粒;花后24~28d,籽粒中新淀粉粒的产生仍在继续;花后35d,主要是最小粒径淀粉粒直径的扩大。与强筋小麦济南17相比较,花后7~14d,弱筋品种鲁麦21胚乳中小于0.6μm的淀粉粒数目百分比较低,大于0.6μm的淀粉粒数目百分比较高,花后17~28d则相反。【结论】灌浆前期鲁麦21胚乳中淀粉粒的增长速率较快,而灌浆后期新淀粉粒合成能力较强。成熟期,济南17籽粒中的B-型淀粉粒所占体积和表面积百分比较高,而弱筋小麦鲁麦21的A-型淀粉粒体积和表面积百分比较高。
摘要:【目的】大麦胚乳发育过程中,淀粉胚乳细胞变成死细胞,本研究阐明这种死亡方式是一种特殊形式的程序性细胞死亡(PCD)。【方法】利用透射电镜和荧光显微镜观察淀粉胚乳细胞核的结构变化,利用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL检测DNA断裂,并对抗氧化酶活性动态和籽粒灌浆速率进行测量。【结果】伴随淀粉胚乳发育进程,大麦淀粉胚乳细胞核呈现出核变形、染色质凝集、核膜破裂和核瓦解形成核残体等一系列PCD过程中核的变化特征。琼脂糖凝胶电泳和TUNEL结果都表明,核DNA发生了有规律的断裂,但DAPI染色结果却表明,核残体并没有从死亡的淀粉胚乳细胞中消失,而是分散存在于淀粉粒之间。Evan’sblue染色表明,死亡的淀粉胚乳细胞在胚乳组织中是随机发生的。在淀粉胚乳细胞核衰退解体和无核的胞质发育过程中,胚乳内抗氧化酶都存在一定的活性,籽粒的粒重也在不断增加。【结论】大麦淀粉胚乳在核衰退解体和无核化的胞质发育时期,胚乳细胞维持较高的代谢活性,没有表现衰退解体特征,直到被贮藏物质所充实才死亡,淀粉胚乳细胞的发育是一种特殊形式的PCD过程。
摘要:【目的】研究棉铃对位叶氮浓度与纤维品质指标的关系,为不同开花期棉铃纤维品质形成的氮素营养监测提供理论依据。【方法】在大田栽培条件下,以高品质棉(科棉1号)和常规棉(美棉33B)品种为材料,分别于江苏南京(118°50′E,32°02′N,长江流域下游棉区)和江苏徐州(117°11′E,34°15′N,黄河流域黄淮棉区)设置不同氮素水平(低氮:0kgN·hm-2;中氮:240kgN·hm-2;高氮:480kgN·hm-2)试验,研究棉铃对位叶比叶重(LMA)、氮浓度(单位干重氮含量,NM;单位叶面积氮含量,NA)对氮素水平的响应,并初步探索了棉铃对位叶NA与纤维品质指标的关系。【结果】(1)棉铃对位叶NA蕴含了NM和LMA的双重信息,具有对氮素水平及开花期均较为敏感的特性,在氮素处理间差异性达显著水平,随开花期的推迟呈现出逐步上升趋势。(2)随着棉铃对位叶NA平均值的增加,棉纤维品质关键指标(纤维长度、比强度、马克隆值、整齐度)的变化趋势均为开口向下的抛物线型。(3)低氮与中氮处理间棉铃对位叶NA平均值的差距随着开花期的推迟逐渐扩大,而高氮与中氮处理间的差距逐渐缩小,相应氮素处理间纤维比强度和马克隆值的差距亦呈现出同样的变化趋势。【结论】棉铃对位叶NA与棉纤维品质指标的关系密切,可作为今后从氮素营养角度实时监测预报棉纤维品质优劣的一个重要生理指标。
摘要:【目的】研究玉米根系构型及其在土壤中的空间分布与氮吸收效率的关系,并通过根系功能-结构模型将根系构型可视化。【方法】以玉米自交系氮高效478与氮低效Wu312为材料,在田间试验的基础上,通过对种子根和不同轮次节根扫描,并以实测根长结果为参数,在改进的根系功能-结构模型的基础上对根系形态进行模拟。【结果】氮高效自交系478的种子根和每一轮节根长度、根系形态,以及根系在土壤空间中的分布都优于氮低效自交系Wu312。从模拟的角度可以看出,478根系具有较大的生长速率和分支密度。对不同轮次节根的发生、生长和衰老规律研究表明,第1~3层节根仅占总根长的很小部分,其根长分别在播种后35、57和76d左右达到最大值,随后开始衰老;第4层以后的节根发生时间集中,与植株进入快速生长期、吸氮速率迅速增加密切相关。第4层以后节根的根长均在播种后93d左右达到最大值,随后开始迅速衰老。【结论】玉米根系形态及其在土壤中的时空分布差异是造成氮素吸收效率差异的重要因素。以根系长度为参数,可以利用根系功能-结构模型实现不同生长发育阶段的玉米根系构型差异的可视化。
摘要:【目的】定量检测打顶对烟株钾离子通道基因表达的影响,为从分子水平上研究打顶对烟草钾素营养调控机理提供理论依据。【方法】在盆栽基质培养条件下,利用实时荧光定量PCR技术检测了打顶后(1h、5h、24h和14d)烟株钾离子通道基因表达的变化,并通过酶联免疫法分析烟株内源激素的含量。【结果】与不打顶处理比较,打顶能够降低整株钾累积量,有利于钾素向叶和根中分配;能够抑制NKT1和NTORK1基因在叶中表达,诱导其在根中表达。NKT1叶中表达量高于根,NTORK1在打顶后24h内叶中表达量高于根,打顶后14d根中表达量高于叶。根中钾离子通道基因表达是调控根系钾素累积和决定地上部K+浓度的关键。打顶有利于K+从根系细胞质膜中流出,导致由根系向地上部运输的K+减少,从而使烟叶中钾累积量降低。打顶对钾离子通道基因表达的调控作用与烟株内源激素水平变化有关,打顶后叶中IAA含量降低,根中IAA含量增加,其中14d时根中IAA比不打顶处理增加了140.7%。【结论】打顶后烟株内源激素水平变化可能是调控钾离子通道基因表达的主要原因,而钾离子通道基因表达的变化直接影响着烟株体内钾素累积和分配。
摘要:【目的】分子克隆水稻基因OsBTF3启动子片段,明确其对靶基因表达的启动作用,为抗病转基因水稻研究提供理论依据和启动子元件材料。【方法】对OsBTF3编码区上游1387bp的启动子(OsBTF3p)序列进行了克隆和序列分析,构建了OsBTF3p∷GUS融合基因植物表达载体pCAM-OsBTF3p,利用农杆菌介导的水稻遗传转化,获得了39株OsBTF3p∷GUS转基因植株,对OsBTF3p进行了启动活性、组织特异性及病原菌诱导性分析。【结果】分子克隆了OsBTF3p片段,其序列与GenBank中的已知序列一致。在转基因水稻愈伤组织中能够检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。在转基因水稻叶片维管束组织和根部组织能检测到GUS活性。水稻白叶枯病菌(Xoo)侵染后OsBTF3p驱动的GUS活性明显地上调表达。【结论】OsBTF3p具有驱动GUS基因表达的启动活性、组织表达特异性和病原菌诱导性。
摘要:【目的】大多数的植物防御素对不同的病原菌具有抗菌活性,其中来自苜蓿种子的防御素alfAFP的转基因土豆和番茄已经被证明对病原菌具有强抗病性。进一步研究该基因对稻瘟病、纹枯病、白叶枯病三大重要病害的抑制作用,对水稻抗病基因工程研究具有重要的意义。【方法】本试验将alfAFP构建到表达载体pPIC9K上,电转化毕赤酵母(GS115),再进行蛋白质的分泌性诱导表达,最后进行体外重组蛋白对水稻病菌的抑菌活性检测。【结果】通过15%的SDS-PAGE检测,得到大约6.5kD的重组蛋白。alfAFP融合蛋白对水稻纹枯病、稻瘟病和白叶枯病均具有一定的抑制活性,其中对纹枯病的作用最为明显。【结论】alfAFP在酵母中成功诱导表达,并对水稻测试病菌具有一定的抑制活性,预示着alfAFP防御素基因在水稻抗病基因工程中具有潜在的应用价值。
摘要:【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69kD,表达水平29.77mg·L-1,水解酪素酶活力27800U·g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。
摘要:【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体(single chain variable fragment,ScFv)基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750bp,其中重链可变区(VH)基因有360bp,轻链可变区(VL)基因有342bp,中间连接肽基因45bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质[0]的研究打下了基础。
摘要:【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾(Spodoptera litura)GOBPⅠ(SlGOBPⅠ)的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在pET-32a/BL21(DE3)系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列(GenBank登录号为EU086372),序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气味结合蛋白氨基酸序列具有较高的相似性,表明SlGOBPⅠ属于GOBP家族。将SlGOBPⅠ编码序列,克隆到表达载体pET-32a上,构建原核表达载体pET-SlGOBPⅠ,在表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为32.0kD的可溶性融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了SlGOBPⅠ融合蛋白,以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了SlGOBPⅠ的抗血清,ELISA滴度为1﹕5000,Western印迹检测结果显示,SlGOBPⅠ抗血清与表达的融合蛋白质呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白保持原有的免疫原性。【结论】克隆、分析和表达了编码斜纹夜蛾气味结合蛋白GOBPⅠcDNA序列,为今后深入研究斜纹夜蛾GOBPⅠ基因的结构和功能奠定了基础。