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中国病毒学 2006年第06期杂志 文档列表

中国病毒学杂志研究报告

HIV-1附属蛋白特异性细胞毒性T细胞应答研究529-535

摘要：人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）附属蛋白Nef、vpu、Vpr和Vif在病毒复制中起着关键作用，并能被细胞毒性T细胞（Cytotoxic T Lymphocyte，CTL）识别。然而，对我国HIV感染者体内附属蛋白特异性的CTL应答研究比较少。本研究应用覆盖HIV-1B、C亚型附属蛋白（Nef、Vpu、Vpr和Vif）的142个肽段作为抗原，通过酶联免疫斑点实验（Enzyme—Linked Immunospot，ELISPOT）检测61例中国HIV／AIDS患者和10例HIV-1血清阴性对照的HIV-1附属蛋白特异性CTL应答。无论对HIV-1B亚型还是HIV-1C亚型附属蛋白都能产生特异性CTL应答，特别是Nef区蛋白的反应频率和累积应答强度都较高（P〈0．001），B、C亚型间的应答频率和累积应答强度都无显著差别（P〉0．05），其免疫优势区也大致相同。附属蛋白特异性的累积CTL应答强度将近达到总应答的21％。这些结果表明尽管HIV-1附属蛋白的体积小，但它们在诱导特异性的CTL应答中发挥了重要作用，对评价HIV-1免疫应答的幅度和特异性以及研发针对中国人群的HIV疫苗有重要的意义。

Subscription note of Virologica Sinica535-535

HBV X基因的表达及在真核细胞中对内质网压力的作用536-540

摘要：运用PCR技术获得HBx基因，分别克隆到原核表达载体pET-his和真核表达载体pcDNA3．1（-）上。重组质粒pET-his—HBx转化大肠杆菌BL21（DE3）后，IPTG诱导表达，利用Ni柱纯化后的蛋白免疫家兔，获得特异性的抗-HBx兔抗血清。重组质粒pcDNA3．1（-）-HBx分别转染HepG2和Hep3B细胞系后，经RT-PCR和Western blot检测，证明HBx可以在这两种细胞系中表达。通过报告基因的表达研究了HBx对XBP1和GRP78启动子的激活活性，结果表明瞬时转染HBx的细胞系中，XBP1和GRP78启动子介导的荧光素酶活性比相应的对照细胞增加了3～7倍。通过RT-PCR分析证明，转染了HBx的细胞中XBP1mRNA发生了剪切。因此，可以初步推断HBx在HepG2和Hep3B细胞中的表达可以引起内质网压力反应，为进一步阐明HBx表达对内质网的影响和肝脏病原发生机制奠定了基础。

我国麻疹病毒流行株的H和N基因变异速率探讨541-545

摘要：从GenBank检索并下载了我国近40年的麻疹病毒血凝素蛋白（H）和核蛋白（N）的全基因组序列，用Bioedit7．0软件对参考株和代表株进行序列比对，并进行氨基酸进化树的构建，进一步从氨基酸层面分析麻疹流行株的变化速率。结果显示麻疹病毒H蛋白发生的变异，表现为近十年的变异率（1．33×10^-3）大约为前三十年变异率（0．95×10^-3）的1．4倍，而N蛋白发生的变异，表现为近些年的变异率（1．90×10^-3）大约为前三十年变异率（1．01×10^-3）的1．8倍。本研究结果提示麻疹病毒近年变异率有增快的趋势，今后需加强对麻疹病毒基因型变异和演变的监测。

HSVⅠ感染人成纤维细胞诱导的SR-15蛋白生物学功能分析546-550

摘要：人单纯疱疹病毒Ⅰ型（Herpes simplex virus Ⅰ，HSVⅠ）结合人成纤维细胞相应受体以启动感染的过程，能够引起细胞产生特异性蛋白分子的表达，其中之一的SR-15蛋白经酵母双杂交系统分析证明可与细胞内多个具有KRAB结构的锌指蛋白产生特异性相互作用，其作用部位为锌指结构域，该作用能够影响该类蛋白之一ZNF268在细胞内的转录抑制作用。

猪源冠状病毒聚合酶基因的克隆及特性分析551-555

摘要：参照GenBank中Purdue株序列对TGEVTS株聚合酶基因（ORF1）设计特异性引物，经RT-PCR扩增获得了20054bp的片段，与预期大小相符。TS株与Pur46-MAD株的ORF1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98．8％和99．0％，与FIPV、PEDV、HCV299E及SARS氨基酸同源性分别为88％、57％、57％和45％。不同冠状病毒比较结果显示RdRp有很高的保守性而且有重要的作用，序列分析标明TS株在ORF1a和ORF1b重叠区有核糖体剪切位点UUUAAAC，且相应区域RNA二级结构形成3个茎环结构。

蓝舌病毒HbC3株诱导人肝癌细胞Hep-3B的凋亡556-559

摘要：采用MTT法检测BTV-HbC3对Hep-3B细胞的增殖抑制作用，流式细胞术检测BTV-HbC3诱导Hep-3B细胞的凋亡情况，透射电镜观察感染BTV-HbC3的Hep-3B细胞超微结构变化。结果表明BTV-HbC3对Hep-3B细胞具有抑制效应，并呈浓度和时间依赖性；BTV-HbC3作用下Hep-3B细胞呈现凋亡特征；BTV-HbC3能有效感染人肝癌细胞株Hep-3B，并在其中有限地复制，同时抑制该细胞增殖，诱导其进入凋亡。本研究证实了蓝舌病毒HbC，株对人肝癌细胞Hep-3B的杀伤及其诱导凋亡作用，结合本室已反复证实该病毒不感染人源正常细胞的事实，提示了该病毒具有抗人肝癌之潜能。

中国病毒学杂志信息

书讯：《病毒分类学》出版发行559-559

中国病毒学杂志研究报告

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用560-564

摘要：根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因（HA）（GenBank：DQ023145）序列设计一对引物P1、P2，以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体，经测序发现在967位A突变为T，形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4，采用重叠延伸剪切法（SOE）用A定点替换T碱基，然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a（＋）中，诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明，表达的重组蛋白能与经BL21（DE3）大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法，该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。

中国病毒学杂志信息

《中国病毒学（英文版）》征订启事564-564

中国病毒学杂志研究报告

特异性抑制伪狂犬病毒EP0基因表达的siRNA分子的合成与筛选565-570

摘要：EP0基因是伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）的早期基因，可能与病毒复制及潜伏感染等有关。为了筛选特异性抑制EP0基因表达的siRNA序列，本研究按照Ambion公司公布的siRNA分子设计原则，设计并合成了3个针对PRVEa株EP0基因的siRNA模板EP04、EP08和EP12，分别克隆到以CMV启动子的siRNA表达载体pSilencer4．1-CMV neo中，构建相应的重组表达质粒p4．1-EP04、p4．1-EP08和p4．1-EP12。同时，将EP0基因的编码区克隆到真核表达载体pEGFP—N3中，按照读码框架与EGFP基因的5’端融合，获得重组表达质粒pEP0-EGFP。将p4．1-EP04、p4．1-EP08、p4．1-EP12和阴性对照质粒p4．1-NK分别与pEP0-EGFP共转染IBRS-2细胞，荧光显微镜观察、流式细胞仪和半定量RT-PCR检测结果表明，三个siRNA分子均能不同程度地抑制EP0基因的表达，抑制效率从高到低依次为EP08、EP12和EP04；在进一步的病毒感染实验中也得到了与细胞转染模型一致的结论。这为深入研究EP0基因在PRV复制和潜伏感染中的作用奠定了基础。

Notice of Inviting Contributions for English Version of Virologica Sinica570-570

新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用571-574

摘要：用RT-PCR方法扩增出新城疫病毒标准强毒株F48E8的F基因，并将其克隆到pGEM-T载体，命名为pGEM-NDF。鉴定正确后，以BamHⅠ和XbaⅠ双酶切将F基因从pGEM-NDF中释放出来，并插入到pFast BacⅠ载体中，得到重组转移载体pFast—NDF。然后将该重组质粒转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中，通过转座作用获得重组穿梭质粒reBacmid—NDF。再用reBacmid—NDF转染Sf9昆虫细胞，获得含有新城疫病毒F48E8株F基因的重组杆状病毒。间接免疫荧光和Western-blot分析结果表明F蛋白在昆虫细胞中获得表达，而且主要表达于细胞膜上，并使感染重组杆状病毒的昆虫细胞在96h发生融合作用。动物试验表明，表达的F蛋白能够产生中和抗体。本文的研究结果为F蛋白的进一步开发奠定了基础。

中国2000—2004年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析575-580

摘要：对2000-2004年从中国9个省市分离到的13株IBV的核蛋白基因片段进行序列测定及分析的结果表明，13株IBV分离株核蛋白基因均含有一个长1230bp的ORF，但存在基因突变现象。与GenBank中的42株参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析，系统进化关系显示55株IBV毒株分属于9个群。第Ⅰ-Ⅲ群主要包括美国、日本、荷兰等国家以及中国的部分IBV分离株和疫苗株。其中本研究中的CK／CH／LHN／00I可能为一株分离的疫苗毒，CK／CH／LSD／031、CK／CH／LDL／01I可能为重组毒。而中国近十年来分离的IBV毒株主要分布在第Ⅵ一Ⅷ群中，此3群内IBV毒株之间N蛋白推导氨基酸同源性为88.3％～100％，与其他各群之间同源性为62．3％-95．1％。因此，此基因型的IBV毒株可能在中国已有较长时期的存在且发生了较大程度的变异。其中第Ⅵ群中两株韩国分离株与中国IBV分离株具有较近的亲缘关系。以上结果表明，中国大多数IBV分离株在N基因进化关系上较为独立，与国外毒株相比，和韩国毒株进化关系密切。此外，中国IBV毒株基因重组现象更加普遍，尤其是疫苗毒和野毒之间的重组。

鹅细小病毒vp基因片段的原核表达及抗血清的制备581-584

摘要：以鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）HG5／82株基因组作为PCR反应模板，扩增印基因3’端长864bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple克隆载体后转化入大肠杆菌TG1。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和HindⅢ将外源基因定向克隆到原核表达载体pET-30a，阳性重组质粒经确证性序列测定，证明外源片断插入到pET-30a的预期位置。将其转入大肠杆菌BL21，经终浓度为0．6mmol／L的IPTG诱导，SDS—PAGE表明外源基因获得表达，融合蛋白分子量约为34kDa。将诱导后的工程菌用6mol／L盐酸胍裂解，经超声处理后离心，利用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。用纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗该融合蛋白的抗血清。Western blotting结果表明制备的兔抗血清与该融合蛋白及亲本病毒的结构蛋白都具有反应性。结合前期工作进展对GPV VP蛋白的B细胞线性抗原表位进行定位。

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19的融合表达及其抗病毒感染作用585-588

摘要：根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因叩19的序列，设计并合成引物，PCR扩增得到vp19基因并克隆到pGEM—T载体中，经过BamHⅠ／HindⅢ酶切、连接并将vp19插入到pET32b表达载体中。用重组质粒pET32b-vp19转化大肠杆菌Origami（DE3）pLysS，在IPTG诱导下，融合蛋白Trx—VP19以可溶性的形式得到表达，经SDS-PAGE和Western-blot检测显示其分子量与预期的大小相符合。目的蛋白经Ni^2＋柱纯化并定量后分别直接注射鳌虾和包被饲料投喂鳌虾。实验结果表明注射Trx—VP19可以提高鳌虾个体抗WSSV感染力的作用。

家蚕抗菌肽CD高效表达及其抗BmNPV感染作用589-593

摘要：通过大肠杆菌JM109诱导家蚕，提取其脂肪体总mRNA后，通过RT-PCR得到cDNA，根据GenBank上家蚕抗菌肽Cecropin D的cDNA序列，设计并合成引物，然后PCR扩增得到Cecropin D肽基因并克隆到pGEM-T载体中，经过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，连接并将Cecropin D肽基因插入pET32a表达载体中。用重组质粒pET32a-ecropin D转化大肠杆菌BL21（DE3），在IPTG诱导下，融合蛋白Trx-Cecropin D以可溶形式得到高效表达，经SDS-PAGE检测显示分子量为23kDa与预期大小相符，表达量约为总蛋白的30％。融合蛋白经Ni^2＋柱纯化后通过肠激酶切割后释放为1h（18kDa）和Cecropin D（5kDa），最后通过超滤管分离得到重组抗菌肽。通过抑菌实验测得重组Cecropin D对于革兰氏阴性及阳性菌均有抑菌活性。并将重组Cecropin D与家蚕病毒BmNPV作用混合4h后，一起投喂家蚕，发现病毒感染力有明显降低，说明其有抗病毒感染作用。

缺失p10基因的重组棉铃虫病毒导致多角体囊膜包装不完整594-598

摘要：P10蛋白是杆状病毒感染细胞后在极晚期高度表达的两个蛋白之一。本文通过构建p10缺失的重组棉铃虫病毒来研究P10的功能。利用九噬菌体Red重组系统介导的同源重组，在大肠杆菌BW25113中，用含有40bp同源臂的氯霉素抗性基因替换了棉铃虫病毒（HaSNPV）细菌人工染色体HaBacHZ8上的p10基因，然后利用Bac-to-Bac系统把多角体基因和绿色荧光蛋白基因转移到含有缺失p10的HaBacHZ8上，构建了p10缺失的重组HaBacAp10-PH-eGFP。重组病毒的生长曲线和生物测定结果表明，缺失p10基因对病毒复制和毒力无显著影响，但电镜观察结果显示，P10的缺失会影响多角体囊膜的包装。