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摘要:目的:使用表达耐热蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌重组工程菌E. coli BL21/pET-Spase和耐热纤维二糖磷酸化酶的大肠杆菌重组工程菌E. coli BL21/pET-Cpase,发酵培养后粗酶液作为催化剂,以价格低廉的蔗糖为原料合成红景天苷。方法:分别构建耐热蔗糖磷酸化酶和耐热纤维二糖磷酸化酶大肠杆菌重组菌,然后将重组菌、蔗糖、酪醇和磷酸混合,得到反应混合物,使反应混合物在45℃下转化,而产生红景天苷。结果:在耐热蔗糖磷酸化酶酶液1200 U/L、耐热纤维二糖磷酸化酶酶液500 U/L、蔗糖110 g/L、酪醇30 g/L和磷酸50 m M的浓度下,反应条件为pH 7.0、温度45℃、转速50转/分、反应时间32小时后,红景天苷浓度达到23.7 g/L。结论:本研究使用蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶联合催化的工艺,成功地高收率合成了红景天苷。同时,本研究构建的耐热磷酸化酶酶活高,处理简单,为拓展糖苷类似物的合成提供了一种新的方法。
摘要:目的:利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1, MTHFD1))基因敲除人胚肾(HEK-293)稳定细胞系。方法:利用在线软件筛选出评分最高的3条针对MTHFD1基因的单向导RNA (sg RNA),然后合成sg RNA序列并将其插入到含有GFP标签的质粒中;重组质粒转染HEK-293细胞后通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞,通过测序确认单克隆细胞系中MTHFD1的DNA序列突变状态;最后应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测单克隆细胞中MTHFD1的m RNA和蛋白表达水平。结果:重组载体中含有正确的sg RNA序列;测序结果显示该细胞系中MTHFD1基因发生了单个碱基插入突变和6个碱基的缺失突变;RT-qPCR结果显示单克隆细胞系中MTHFD1在m RNA水平显著降低;Western blot检测成功构建MTHFD1蛋白缺失的HEK-293细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建的MTHFD1敲除HEK-293细胞系。
摘要:目的:利用Cre-loxp可诱导系统构建活化的肝星状细胞RBP-J可诱导性基因敲除小鼠模型,以实现肝纤维化过程中活化的肝星状细胞Notch信号通路的特异性阻断。方法:将Sm22α^CreERT2和RBP-J^flox/flox转基因小鼠杂交,得到F1小鼠,将繁殖的F1小鼠继续进行交配,得到F2小鼠,通过PCR鉴定出基因型为Sm22α^Cre ERT2,RBP-J^flox/flox的小鼠。通过腹腔注射四氯化碳建立肝纤维化模型,检测四氯化碳注射不同时间段后肝脏纤维化进展情况和肝星状细胞活化过程中Sm22α的表达情况。注射他莫昔芬诱导活化肝星状细胞中RBP-J基因的特异性敲除。分选肝星状细胞,q-PCR和Western Blot检测活化肝星状细胞中Notch下游靶基因Hes1、Hey1表达情况以验证敲除效果。结果:通过连续交配我们获得了Sm22α^Cre ERT2,RBP-J^flox/flox小鼠。四氯化碳腹腔注射4周即可诱导肝脏发生较为明显的纤维化,同时肝星状细胞活化并逐渐高表达Sm22α。给予他莫昔芬诱导Cre重组酶发挥作用后,敲除了活化的肝星状细胞中的RBP-J基因,其下游基因Hes1、Hey1表达降低70%以上,阻断了Notch信号通路。结论:我们成功构建了RBP-J可诱导性条件性基因敲除小鼠模型,实现了小鼠肝纤维化过程中活化肝星状细胞Notch信号通路的阻断,为深入研究Notch信号通路在肝纤维化中的作用和机制奠定了坚实的基础。
摘要:目的:雄性原始生殖细胞在植入生殖嵴后,会从有丝分裂退出进入静息状态,在这一过程中伴随着细胞内代谢状态的改变,本研究旨在体解析原始生殖细胞增殖的改变与细胞代谢之间的因果关系。方法:通过体内Brdu掺入实验明确不同时间点雄性生殖细胞的增殖状态;分析比较增殖状态和静息状态原始生殖细胞糖酵解相关基因的表达;利用腹腔注射HK2特异性抑制剂2-Deoxy-D-glucose (2-DG),构建糖酵解抑制小鼠模型;通过免疫荧光与qPCR分析抑制糖酵解后原始生殖细胞的表型。结果:免疫荧光结果显示雄性生殖细胞增殖停滞从E13.5开始,至E15.5完全停滞;qPCR和Western Blot显示在此过程中HK2的表达是逐渐降低的;在E11.5抑制小鼠胚胎中的糖酵解过程,可以在E13.5检测到雄性PGCs增殖下降,并且可以抑制多能性基因如Sox2、Oct4的表达。结论:研究发现,E11.5-E13.5雄性原始生殖细胞内增殖与多能性的维持需要糖酵解。改变胚胎糖酵解水平可以影响原始生殖细胞增殖分化进程。
摘要:目的:探讨小檗碱在棕榈酸(palmic acid, PA)诱导的胰岛β细胞发生凋亡时PTEN及AMPK的变化及其作用机制。方法:采用1.0 mmol/L PA诱导胰岛βTC6细胞损伤模型,然后给予小檗碱干预。采用流式细胞术检测βTC6细胞凋亡率,RT-q PCR法及免疫荧光法检测在PA及小檗碱作用下信号转导通路分子PTEN及AMPK表达的变化。结果:PA抑制βTC6细胞的生长并诱导其凋亡,小檗碱可缓解PA引起的βTC6的凋亡,对氧化应激具有保护作用;伴随着凋亡的发生,AMPK的表达显著降低,而PTEN的表达显著升高,表明细胞氧化损伤严重时抑制了AMPK的表达及转录,而PTEN在βTC6细胞的凋亡中具有促进作用;小檗碱治疗后,AMPK的表达增多,而PTEN的表达下降,暗示着小檗碱通过激活AMPK并抑制PTEN的表达来增强βTC6细胞的抗氧化能力。结论:小檗碱对PA引起的细胞凋亡有保护作用,同时小檗碱可能通过调节AMPK及PTEN的表达来发挥抗氧化作用。
摘要:目的:可降解锌合金材料有适中的降解速率,良好的机械性能。目前对于锌合金的体内生物安全性研究多集中于生物体内植入适量的锌合金材料。对于体内植入大量的可降解锌合金材料是否有不良影响,还未见文献报道。本实验从局部和全身反应来研究埋植过量可降解锌合金的早期生物安全性。方法:选取18只新西兰大白兔分为三组,于皮下植入锌合金内固定板及钉各4、6、8块,于术后3月、6月行大体观察,血常规、血生化、血液微量元素检查,内脏和材料周围组织的组织学检查和ICP-OES定量检测内脏锌含量观察锌的脏器蓄积情况,材料称重计算每日释放锌含量。结果:可吸收锌合金材料表面附着的白色粉末状物质随时间增加而增多,去掉表面白色物质后,材料表面愈加粗糙,术后3月、6月的白细胞计数(WBC),红细胞计数(RBC),谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST),总蛋白(TP),白蛋白(ALB),尿素氮(BUN),肌酐(Cr),血锌,血镁,血钙、血铜与术前相比无统计学差异。术后6月实验动物材料周围组织,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、性腺未检出异常。术后3月、6月肝脏、肾脏、脾脏的锌离子含量与术前相比无统计学差异。综合计算得到术后3月可降解锌合金内固定板的降解率为9.77±1.64%,术后6月为11.82±1.91%,螺钉的降解率术后3月为0.79±0.66%,术后6月为2.09±1.00%。结论:大量可降解锌合金植入体内的早期生物相容性良好。
摘要:目的:足踝部特殊的解剖结构使其在手术或创伤打击之后易发骨髓炎,本文介绍了足踝部慢性骨髓炎的治疗策略及治疗结果。方法:回顾性分析2010年1月到2015年12月于我科治疗的足踝部慢性骨髓炎患者的临床特点及治疗结果,纳入患者术后随访至少2年,有糖尿病或免疫缺陷者被排除在研究之外。骨髓炎的病因,原发部位,致病菌,是否累及临近关节及骨髓炎复发情况被纳入评估,所有患者术前均进行SPECT/CT检查,用以评估骨髓炎感染的范围以及是否累及临近关节。手术治疗策略包括彻底的病灶清除,去除死腔以及累及关节时进行关节融合等。结果:足踝部慢性骨髓炎最常见的病因是创伤后的开放骨折或脱位,占所有患者的70%。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌是最常见的致病病原体。在45%的患者中,骨髓炎侵犯邻近关节,所有累及关节患者均进行了关节融合术。平均住院天数为16.5天。20例患者中18例无复发。结论:足踝部慢性骨髓炎发生邻近关节侵犯时,在进行彻底的病灶清除和去除死腔后,进行关节融合可获得良好疗效。