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摘要:目的:本项目将通过构建中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)真核表达系统获取小鼠Vsig4膜外端和免疫球蛋白Ig G3a-Fc段的融合蛋白,鉴定Vsig4-Fc和Vsig4纳米抗体的相互作用。方法:采用重合延伸PCR法融合小鼠Ig G3a-Fc和Vsig4胞外段的基因序列,将该融合基因插入真核表达载体中并转染CHO细胞。Western blotting鉴定转染细胞上清中的目标蛋白,通过连续两次亚克隆筛选,获得高表达小鼠Vsig4-Fc融合蛋白的单克隆,之后大量培养增殖转染细胞并收集细胞培养上清,选择Protein A柱纯化方法纯化Vsig4-Fc蛋白,最后经ELISA法鉴定Vsig4-Fc和纳米抗体的结合能力。结果:在CHO细胞中成功构建了小鼠Vsig4-Fc真核表达稳转系,并且在真核表达体系中获得可表达15 mg/L的双分子结构Vsig4-Fc的稳定转染细胞系。经鉴定小鼠Vsig4-Fc融合蛋白能与Vsig4纳米抗体结合。结论:重合延伸PCR法使得Vsig4和Fc基因片段的融合更为高效,两次亚克隆筛选优势细胞系大幅提高了真核蛋白的表达量,为进一步研究Vsig4的生物学功能奠定重要基础。
摘要:目的:研究细辛的肾毒性及其与细辛剂型剂量之间的相关性。方法:以灌服蒸馏水为空白对照,分别以不同剂量的细辛水煎剂、细辛散剂和麻黄附子细辛汤复方为受试药物,连续60天给SD大鼠灌胃给药,通过检测尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮等生化指标和观察组织切片,评价细辛不同使用方式对大鼠肾脏的损伤作用。结果:细辛散剂组在3.0 g·kg^-1·d^-1的给药剂量下,各生化指标与空白组比较P〈0.05,有显著性差异,大鼠肾脏组织受到严重损伤,并普遍死亡;在1.5 g·kg^-1·d^-1的给药剂量下,同样引起了大鼠肾组织的明显损伤;在0.3 g·kg^-1·d^-1的给药剂量下,大鼠肾组织未表现出损伤,且生化指标与空白对照组比较P〉0.05,均无显著性差异。当细辛生药量达到33.0 g·kg^-1·d^-1时,细辛水煎剂组方表现出轻微的肾组织损伤,在16.5 g·kg^-1·d^-1和3.3 g·kg^-1·d^-1剂量下,细辛水煎剂组未表现出肾组织病理变化,生化指标与空白对照组比较P〉0.05,均无显著性差异。对麻黄附子细辛汤而言,在细辛生药用量达到16.5 g·kg^-1·d^-1时,开始出现大鼠轻微肾损伤,而在3.3 g·kg^-1·d^-1剂量下未表现出肾组织病理变化,生化指标与空白对照组比较P〉0.05,也均无显著性差异。结论:在大鼠中,肾脏是细辛致毒的靶器官之一,并且大鼠肾损伤与细辛用法用量密切相关,散剂的毒性显著强于水煎剂和复方麻黄附子细辛汤。
摘要:目的:观察雷公藤甲素引起急性肝损伤时肝细胞自噬的情况。方法:采用LC3-GFP质粒尾静脉高压注射的方法在体监测雷公藤甲素诱导肝细胞自噬的发生;用腺病毒双荧光载体m RFP-GFP-LC3感染体外培养的HepG2细胞,通过激光共聚焦显微镜和蛋白印记的方法检测细胞自噬流的强度。结果:小鼠腹腔注射雷公藤甲素(0.25 mg/kg和0.5 mg/kg)24小时,血清中ALT和AST水平均显著升高;肝组织病理结果显示肝细胞肿胀、空泡化及坏死;激光共聚焦显微镜下可检测到LC3-GFP质粒表达所呈现的绿色荧光;离体细胞实验结果证实雷公藤甲素可诱导肝细胞发生自噬流,且表现为一定程度的剂量、时间依赖性。结论:雷公藤甲素可引发急性肝损伤并伴随明显的细胞自噬。
摘要:目的:研究分子氢对糖尿病视网膜小胶质细胞的保护作用及其可能机制。方法:采用100 ng/m L的LPS诱导视网膜小胶质细胞,同时将两组细胞分别置于正常培养环境和含有饱和氢培养环境下培养36小时。RT-PCR检测小胶质细胞中miR-9、miR-21和miR-199的表达。Western Blot测定TLR4信号途径相关蛋白的表达。结果:miR-9、miR-21在分子氢作用后明显下调,而miR-199在分子氢作用后下调不明显。并且,小胶质细胞活化后TLR4途径相关信号蛋白的表达增加,在分子氢处理后Myd88和IKKβ蛋白的表达明显减少,而NF-κB蛋白的表达前后没有明显的变化。结论:分子氢对视网膜小胶质细胞的炎症损伤具有明显的保护作用,氢作为一种信号分子对Myd88介导的TLR4炎症信号通路的调节及通路中部分miRNA的调节作用可能是其抗炎作用的机制。
摘要:目的:探讨不同剂量瘦素预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法:将72只大鼠随机分为对照组、假手术组、心肌梗死组以及大、中、小剂量瘦素预处理组。对照组给予普通饲料喂养,其余各组均给予高糖高脂喂养。1个月后,采大鼠静脉血,检测其血清FBG、FTNS、瘦素、HOMA、TNF-α、MDA及血脂水平。结果:与对照组相比,其余各组FBG、FINS、瘦素水平及HOMA-IR均明显升高(P〈0.05);心肌梗死组及大、中、小剂量瘦素预处理组FBG及瘦素水平与假手术组相比均明显升高,心肌梗死组、高剂量瘦素预处理组FINS及HOMA-IR与之相比亦明显升高,小、中剂量瘦素预处理组FINS及HOMA-IR与之相比均明显降低(P〈0.05);小、中剂量瘦素预处理组FBG、FINS、瘦素水平及HOMA-IR与心肌梗死组相比均明显降低(P〈0.05)。与对照组相比,其余各组大鼠TNF-α、MDA水平均明显升高(P〈0.05);与假手术组相比,心肌梗死组、大、中、小剂量组大鼠TNF-α、MDA水平明显升高(P〈0.05);与心肌梗死组相比,中、小剂量组大鼠TNF-α、MDA水平均明显降低(P〈0.05)。与对照组相比,其余各组大鼠TG、TC、LDL-C水平均明显升高,HDL-C水平均明显降低(P〈0.05);大、中、小剂量组HDL-C值与假手术组相比均明显升高,TG、TC、LDL-C值与之相比均明显降低(P〈0.05);与心肌梗死组相比,小、中剂量组大鼠TG、TC、LDL-C水平均明显降低(P〈0.05),HDL-C水平均明显升高(P〈0.05)。结论:瘦素预处理能够保护糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤,可能与其减轻炎症、氧化应激、血脂紊乱及胰岛素抵抗有关。
摘要:目的:探讨CC类趋化因子配体2(C-C motif ligand 2,CCL2)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达的影响。方法:体外分离培养HUVECs细胞,将HUVECs铺至6孔板中,待细胞融合至80-90%时,将CCL2过表达载体[pc DNA3.1(+)-CCL2]及CCL2小分子干扰RNA(si-RNA)分别转染到HUVECs中,于转染后12 h、24 h和48 h收集细胞进行RNA及蛋白提取。荧光定量PCR方法检测HUVECs中CCL2及ICAM-1基因mRNA表达。Western blotting检测HUVECs中CCL2及ICAM-1蛋白表达。结果:(1)与pc DNA3.1(+)组相比较,pc DNA3.1(+)-CCL2组中CCL2基因mRNA和蛋白水平均显著升高;与si-Control组相比较,si-CCL2组中CCL2基因mRNA和蛋白表达均明显下降。(2)与对照组比较,pc DNA3.1(+)-CCL2组明显增加HUVECs中ICAM-1的mRNA及蛋白表达,而si-CCL2组显著抑制HUVECs中ICAM-1的mRNA及蛋白表达。结论:CCL2能增加HUVECs中ICAM-1基因mRNA和蛋白表达,为深入认识动脉粥样硬化的发病机制提供了理论依据。
摘要:目的:探讨茶色素对人肺鳞癌细胞株SK-MES-1细胞生长及凋亡的影响。方法:以超声细胞破碎法提取茶色素并计算得率。常规培养SK-MES-1细胞株,采用噻唑蓝溴化四唑(MTT)比色法观察不同浓度(5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/mL)茶色素作用24、48 h对SK-MES-1细胞株生长的抑制作用,计算生长抑制率及IC50;以流式细胞术(FCM)荧光双染法(Annexin V/PI)观察茶色素对SK-MES-1细胞株凋亡的影响。结果:茶色素提取得率为7.35%。MTT实验结果显示随茶色素浓度增高和培养时间延长,其对细胞的生长抑制率也相应升高,即呈现剂量-时间依赖性,24 h和48 h处理的IC50分别为2.353 mg/mL和1.494 mg/mL。流式细胞术检测作用24 h细胞凋亡,空白对照、0.625 mg/mL和1.25 mg/mL剂量组的SK-MES-1细胞凋亡率分别为7.7%、20.37%和25.25%。结论:茶色素可促进SK-MES-1细胞凋亡并抑制其增殖。
摘要:目的:来源于植物β-葡萄糖苷酶活性检测的方法学研究。方法:以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物,β-葡萄糖苷酶为催化剂催化底物生成对硝基苯酚,用紫外分光光度法测定对硝基苯酚的含量,根据生成的对硝基苯酚含量计算酶活性,并对此进行方法学研究。结果:对硝基苯酚标准曲线的相关系数为0.999;催化反应的线性相关系数为0.999;反应精密度的相对标准偏差为0.05%;方法重复性的相对标准偏差为2.8%;方法耐用性考察中,酶活性均大于1200 U/g,九个不同方法参数的酶活性相对标准偏差为4.6%;中间精密度实验中,十二份样品酶活性的相对标准偏差为6.6%;稳定性实验中,β-葡萄糖苷酶与底物反应后,放置0小时、16小时、22小时后,测定的酶活性均大于1200 U/g,相对标准偏差为1.1%。结论:此方法线性较好,有良好的方法重复性、精密度、中间精密度、耐用性和溶液稳定性,适用于来源于植物的β-葡萄糖苷酶活性检测。
摘要:目的:探讨高浓度葡萄糖对体外培养大鼠胰岛细胞凋亡的影响及作用机制。方法:SD大鼠胰岛细胞原代培养,不同浓度的葡萄糖处理后,采用MTT比色法检测细胞存活率,Hoechst-PI染色观察细胞凋亡,电镜观察细胞超微结构改变,RT-PCR方法检测Bax及Bcl-2相关基因mRNA表达水平。结果:5.5 mmol·L^-1,11.1 mmol·L^-1和22.2 mmol·L^-1葡萄糖处理后,胰岛细胞活性分别下降到78.08%±2.29%、58.39%±3.13%和36.05%±2.63%,与阴性对照组比较差异具有统计学意义(P〈0.05);Hoechst-PI染色结果显示随着葡萄糖作用浓度的增加,凋亡细胞数量也增加;RT-PCR显示胰岛细胞经不同浓度葡萄糖处理后,Bax mRNA的表达明显上调,Bcl-2 mRNA表达下调(P〈0.05);电镜观察结果显示随着葡萄糖作用浓度的增加,胰岛细胞超微结构损害程度依次加重。结论:高浓度葡萄糖能明显引起胰岛细胞活性的下降,诱导凋亡反应的发生,凋亡机制与Bcl-2家族蛋白相关。
摘要:目的:构建人类表皮生长因子域7(EGFL7)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒表达载体。方法:参照小分子干扰RNA的设计原则,应用Oligo Designer 3.0软件设计三条靶向人EGFL7基因的RNA干扰序列(hEGFL7-RNAi),并将其分别插入含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体pLV3中,获得重组质粒,与包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G共同转染293T细胞,包装产生重组慢病毒,培养72 h后,应用qRT-PCR检测慢病毒感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后靶基因mRNA的水平,以评价其基因沉默效果。结果:筛选出3条人EGFL7基因的RNAi序列,分别包装出重组慢病毒,其滴度分别为1×10^8、2×10^8和5×10^8TU/mL,将其转染入HUVEC后,EGFL7mRNA表达均受到明显抑制(P〈0.05)。结论:成功筛选出三条针对人EGFL7基因的RNAi有效靶序列,并成功构建重组慢病毒表达载体,证明该序列可沉默HUVECs中EGFL7基因的表达。
摘要:目的:初步探讨糖原合成激酶3β(GSK3β)与乙肝病毒胎盘组织感染关系,为进一步研究乙肝病毒在宫内感染中的作用机制奠定基础。方法:选择2011年-2012年在哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科剖宫产结束妊娠的乙肝表面抗原阳性(HBsAg+)孕妇60例(实验组),正常妊娠孕妇的胎盘组织20例(对照组)。于分娩前留取孕妇肘静脉血,分娩时留取脐血及胎盘组织。采用ELISA法检测实验组静脉血及脐带血的乙肝五项与HBV-DNA定量;采用免疫组化方法,检测各实验组中HBsAg的表达及分布;检测实验组与对照组GSK3β的分布及表达情况;采用TUNEL法检测实验组及对照组细胞凋亡情况。结果:60例HBsAg(+)产妇中,37例脐带血HBsAg阳性,12例脐带血HBV-DNA阳性;实验组胎盘组织中均检测出HBsAg、GSK3β蛋白表达,且随着血清HBV-DNA滴度增高,HBsAg与GSK3β的表达均呈增高趋势(P〈0.05);实验组和对照组的胎盘组织中均可检测出凋亡细胞,实验组的凋亡程度低于对照组,随HBV-DNA滴度增高,凋亡呈下降趋势(P〈0.05)。结论:在乙肝病毒的垂直传播过程,HBsAg可能通过GSK3β抑制胎盘细胞凋亡,影响正常胎盘组织的屏障功能,可能是造成宫内感染的相关机制。
摘要:目的:探究血清水通道蛋白4(AQP-4)与急性期视神经脊髓炎(NOM)患者临床特征的相关性,为临床上预防急性期NOM患者提供参考。方法:选取2009年1月至2016年1月来我院治疗的63例NOM患者,另选取20例健康体检者为对照,采用酶联免疫吸附试验测定所有受试者血清中AQP-4抗体浓度,分析AQP-4抗体水平与NOM患者临床特征的关系。结果:NOM患者血清AQP-4抗体的浓度为(425.45±18.34)ng/ml,阳性检出率为80.73%。健康体检者血清AQP-4抗体的浓度为(112.34±15.27)ng/ml。Spearman相关性分析发现,血清AQP-4抗体水平与EDSS评分、大脑磁共振成像病灶数及脊髓受累节段数均呈正相关(r=0.383,P=0.001;r=0.315,P=0.007;r=0.297,P=0.012);与至下一次复发间隔时间之间无明显相关性(r=-0.096,P=0.332)。结论:AQP-4抗体水平与NOM疾患者临床症状以及病程严重程度有一定的相关性,但AQP-4作为预测疾病复发的检测蛋白意义不大。
摘要:目的:探讨Survivin及Anx-A1在肝癌组织中的表达及其临床意义。方法:收集原发性肝癌病例45例,采用免疫组织化染色法检测Survivin及Anx-A1在肝癌组织及癌旁正常组织中的表达,分析Survivin及Anx-A1的表达与肝癌临床病理特征的关系。结果:Survivin在肝癌组织中的阳性表达率为86.67%,在癌旁正常组织中的阳性表达率为17.78%;Anx-A1在肝癌组织中的阳性表达率为46.67%,在癌旁正常组织中的阳性表达率为8.89%;Survivin及Anx-A1在肝癌组织中的阳性表达率均显著高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P〈0.05);不同肿瘤分级患者肝癌组织中Survivin与Anx-A1的表达水平存在显著差异(P〈0.01),肿瘤分级越高,Survivin与Anx-A1表达水平越高。结论:Survivin及Anx-A1的表达与肝癌的发生发展密切相关,可用于肝癌的辅助诊断。
摘要:目的:探讨衰弱对老年急性冠脉综合征(ACS)患者短期预后的影响。方法:选择2015年8月1日至2015年12月31日在我院老年医学中心住院的181例ACS患者为研究对象。全面评估患者临床特征和合并症情况,采用国际老年营养学会提出的简易虚弱问卷(FRAIL)评估患者的衰弱情况,并根据评估结果将患者分为衰弱组(n=108)和非衰弱组(n=73)。采用门诊随访和电话随访的方式进行3个月随访,分析衰弱对ACS患者预后的影响。结果:共有181例患者纳入研究,随访率100%,其中衰弱患者108例(59.67%)。随访期两组患者再住院、全因死亡和再发急性心肌梗死等随访终点事件发生率比较,差异均有统计学意义(P〈0.05)。多因素Logistic回归分析结果提示衰弱是老年ACS患者短期再住院、全因死亡和再发急性心肌梗死的独立风险因素(OR=3.286,4.976,4.346;P=0.032,0.022,0.012)。结论:衰弱是老年ACS患者再住院、全因死亡和再发急性心肌梗死等短期预后的独立风险因素。
摘要:目的:探讨产前B超对胎儿完全性大动脉转位的临床诊断价值。方法:回顾性分析2012年2月至2015年11月我院收治的4例胎儿完全性大动脉转位的B超特征,并对比病理结果。结果:4例完全性大动脉转位胎儿中,1例室间隔缺损,3例四腔心切面正常。左右两室流出道切面情况:4例胎儿大动脉与心室连接关系存在异常,2例胎儿室间隔膜部存在缺损症状。三血管气管切面情况:4例胎儿均仅可见2条血管。结论:对左右两心室流出道切面及三血管气管切面进行观察可得,胎儿完全性大动脉转位具有较为明显的B超特征,产前对胎儿完全性大动脉转位进行B超诊断具有较好的临床价值,建议在医疗单位推广应用。
摘要:目的:观察经桡动脉介入诊治冠心病的安全性和有效性。方法:对1503例患者进行了经桡动脉途径介入诊治,其中包括心绞痛患者1218例,心梗患者268例,二尖瓣和/或动脉瓣手术前对冠状动脉进行解剖学评估17例,观察患者手术安全性、成功率以及与经桡动脉手术相关的并发症发病率。结果:介入治疗成功率为93.1%(1400/1503),手术失败的主要原因为桡动脉穿刺失败(39例),严重桡动脉痉挛(42例),右锁骨下动脉不同程度的弯曲(18例),近端严重狭窄(14例)。术后有14例患者出现严重并发症(瞬时缺血性病变),60例出现有症状的窦性心动过缓,43例出现静脉血栓,77例出现血肿,88例出现桡动脉梗阻。结论:经桡动脉途径是一种安全、有效、患者更容易接受的冠心病介入诊治方法。
摘要:目的:探讨Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated death domain protein,FADD)在乳腺癌中表达的临床病理学意义。方法:收集乳腺癌病例及相应的临床资料包括随访资料,应用免疫组织化学技术检测乳腺良性病变,有/无淋巴结转移的乳腺癌及配对淋巴结转移灶中FADD的表达,观察分析FADD表达与乳腺癌患者年龄、肿块大小、临床分期、组织学类型和分级、雌孕激素受体水平等临床病理指标间的关系。结果:免疫组化检测结果显示良性乳腺病变组中FADD的阳性表达率(85.1%,40/47)与无淋巴结转移的乳腺癌组(45.8%,38/83),伴有淋巴结转移的乳腺癌组(67.3%72/107)和淋巴结转移灶(45.8%,49/107)组织中FADD阳性表率均有显著性差异(P值分别〈0.001,=0.022和〈0.001);此外,伴有淋巴结转移的乳腺癌组中FADD阳性表达率也均与其它三组中FADD阳性表达率之间具有显著性差异(P值分别为0.003,〈0.001和0.022)。FADD与患者的确诊年龄(P=0.049)和淋巴结转移有显著性相关(P=0.003),与肿瘤大小、临床分期、组织学类型、组织学分级、雌孕激素受体及cerb B-2的表达情况和月经史无明显相关性(P〉0.05)。生存分析显示FADD阳性表达的患者较FADD阴性患者的生存期更短。结论:FADD与乳腺癌淋巴结转移和预后有关。
摘要:目的:探讨中国汉族人群中载脂蛋白Eε4等位基因与急性脊髓损伤(ASCI)预后的相关性。方法:采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)方法,检测2012年5月-2015年10月就诊于哈尔滨医科大学附属第二医院脊柱外科的50例(男性患者35例,女性患者15例)颈段(C3-C8)脊髓损伤的中国汉族患者载脂蛋白Eε4等位基因的遗传学状态,并以ASIA脊髓损伤神经学分类标准为患者神经功能恢复情况进行评估,分析中国汉族人群中载脂蛋白Eε4等位基因与急性脊髓损伤预后的相关性。结果:在运动方面,载脂蛋白Eε4阴性的患者恢复情况显著强于载脂蛋白Eε4阳性的患者恢复情况(mean 6.1vs 3.7,P=0.04)。而在针刺觉方面,载脂蛋白Eε4阴性的患者恢复情况显著弱于载脂蛋白Eε4阳性的患者恢复情况(mean 4.0 vs 6.1,P=0.03)。在轻触觉方面,载脂蛋白Eε4阴性和阳性患者的恢复情况没有显著的差异(mean 7.4 vs 5.9,P=0.28)。结论:中国汉族人群中载脂蛋白Eε4等位基因与ASCI的预后密切相关:载脂蛋白Eε4阳性不利于患者运动的恢复,利于患者针刺觉的恢复。