自噬相关基因LC3-I的基因表达及单克隆抗体的制备
摘要：目的：通过克隆LC3．I基因，体外原核表达LC3-I蛋白后制备抗LC3单克隆抗体，作为自噬研究中的标记分子检测自噬的发生和发展过程。方法：RT．PCR方法从RAW264．7细胞基因组中克隆LC3基因，亚克隆至pQE80L原核表达载体后转化E．cobDH5a进行诱导表达，SDS—PAGE电泳及Westemblot鉴定表达蛋白。蛋白纯化后免疫BALB／c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术，制备分泌抗LC3．I杂交瘤细胞株，体内诱生腹水制备mAb，间接ELISA法测定其效价，辛酸一硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化mAb。结果：成功克隆了LC3一I基因，并对其在E．coilDH5a进行诱导表达，SDS-PAGE分析表明在相对分子量Mr为20×10^3有特异条带，Westernblot验证表达产物具有一定的生物学活性。建立了3株稳定分泌特异性抗LC3-ImAb的杂交瘤细胞株，诱导产生的腹水获得的抗体效价在10^5-10^7之间，结论：在E．coli中对LC3-I进行表达，并制备特异性较强抗LC3-I蛋白的单克隆抗体。为自噬研究提供了良好的标记分子，可对自噬形成和发展进行有效的检测。左旋多巴甲酯在PLGA微球的稳定性研究
摘要：目的：考察左旋多巴甲酯在PLGA微球中的稳定性并探讨其稳定方法。方法：利用HPLC的方法考察了左旋多巴甲酯在不同pH值和光照的环境中和微球里的稳定性。结果：左旋多巴甲酯在pH3中稳定，在微球中也可以稳定一周。结论：包封左旋多巴甲酯在PLGA微球中，是一种有效地保护了左旋多巴甲酯在微球中的活性，可以实现长效缓释，是一种可行的方案。小鼠眼神经注入Dil后三叉神经节的形态学研究
摘要：目的：经眼神经注入DiI研究小鼠三叉神经节的形态学结构。方法：小鼠10只，体重25—30克，雌雄不拘，进行灌注固定后，在外科显微镜下开颅并确认三叉神经节和眼神经，分别于双侧眼神经植入DiI染色晶体。37℃恒温箱放置3个月，待DiI染色晶体扩散后，取出植入DiI染色晶体的眼神经和三叉神经节，再根据神经走向切片，通过荧光显微镜观察DiI染色晶体在三又神经节内的分布。结果：眼神经离三叉神经节约1cm处植入DiI染色晶体后，应用荧光显微镜明视野观察，均可见到高密度标记的眼神经纤维，行向后内，穿经眶上裂入颅。逐步靠近三叉神经节外上方，并进入三叉神经节内，眼神经标记的神经元位于三叉神经节的前内侧。在三叉神经节内可见到DiI标记的神经节细胞及神经纤维。神经纤维平行致密排列，并被神经节细胞神经纤维分隔成群或簇。神经节细胞呈圆形和卵圆形，大小不一，部分节细胞呈蜂窝状排列。亦可见神经元的突起，有的呈螺旋状连于胞体，有的呈线状连于胞体，并可见到双极神经元。结论：小鼠经眼神经注入DiI后，三叉神经节细胞和神经纤维的排列循序跟其他动物基本一致。mTOR／STAT3信号通路在谷氨酸诱导的PC12细胞损伤中的作用
摘要：目的：研究谷氨酸（glutamate，GIu）诱导PCI2细胞损伤后mTOR／STAT3信号通路的表达情况及对细胞损伤的保护作用。方法：用不同浓度谷氨酸作用不同时间诱导PCI2细胞损伤，筛选出合适的浓度和作用时间后，将细胞分为3组进行下一步实验，分别为A组：正常对照组；B组：20mmol／L谷氨酸处理组；C组：20mmol／L谷氨酸＋800nmol／L雷帕霉素（rapamycin，RAPA）处理组。应用流式细胞术检测各组处理12h后细胞凋亡率，Westernblot观察各组处理1h、4h、8h、12h后，P-mTOR，P-STAT3蛋白表达情况。结果：（1）谷氨酸对PCI2细胞的生长抑制作用随作用时间和作用浓度的增加而增强。（2）C组凋亡率明显高于A组和B组。（3）Westernblot检测结果表明B组各时间点p-mTOR，P．STAT3表达均高于A、c组，并在4h时达到高峰。结论：细胞损伤激活了mTOR／STAT3信号通路，该通路的激活减少了细胞凋亡，对谷氨酸导致的神经细胞损伤具有保护作用，有助于神经损伤的修复。乳液法神经生长因子（NGF）电纺纤维的体外研究
摘要：目的：使用乳液法制备含有神经生长因子（NGF）的电纺纤维，研究其外观形貌和机械强度等物理性能，以及制备过程中NGF活性的变化，纤维中NGF的担载量和纤维体外释放动力学，评价其能否成为理想的神经修复材料，为进一步将NGF电纺纤维应用于周围神经修复奠定基础。方法：将NGF水溶液分散于PLLA溶液，通过W／O乳液法制备静电纺丝缓释纤维，对纤维的外观形貌等物理性能等进行表征，使用Elisa方法测定制备过程中NGF活性的保持以及体外释放动力学。结果：NGF电纺纤维具备类似细胞外基质（ECM）的良好外观形貌和一定的机械强度，其中NGF活性保持19．58％士6．05％，体外有效释放11天。结论：本文制备的乳液法NGF电纺纤维具备良好的物理性能，能够持续缓释有效剂量的NGF，适合作为神经修复材料进行进一步研究。p27kip1蛋白在胶质瘤细胞中的表达及定位研究
摘要：目的：探讨胶质瘤细胞中p27酬蛋白的表达、定位，为进一步研究p27kip1在胶质瘤发生、发展过程中的功能奠定理论基础。方法：用免疫荧光方法检测U87、LN308细胞p27kiP1蛋白的定位情况；进一步分离两种细胞的细胞质与细胞核，在显微镜下观察细胞核形态并用DAPI染色分析细胞核完整性，提取蛋白用Westernblotting。方法检测分离的细胞质与细胞核蛋白的纯度，并检测p27kip1，在细胞中的表达情况。结果：成功分离了细胞的细胞浆与细胞核，并得到纯度较好的细胞浆蛋白与细胞核蛋白。确定了p27kip1蛋白主要表达于U87和LN308细胞的细胞质中。结论：p27kip1蛋白在恶性胶质瘤中可能主要表达在细胞质中，并且其亚细胞定位可能与胶质瘤的恶性程度相关。糖耐康含药血清对高糖状态下大鼠肝细胞糖脂代谢的影响
摘要：摘要目的：研究糖耐康含药血清对高糖状态下大鼠肝细胞糖脂代谢的影响。方法：通过培养大鼠肝细胞，在高糖诱导肝细胞胰岛素抵抗状态下，给予高、中、低剂量的糖耐康含药血清共培养24h后，观察肝细胞增殖情况，用葡萄糖氧化酶法检测细胞的葡萄糖消耗量，培养基和肝细胞内TG含量，肝细胞糖原含量。结果：与正常组比较，高糖刺激下，肝细胞增殖显著受到抑制（P〈O．叭）、葡萄糖消耗量和糖原含量减少（P〈0．01），TG含量增加（P〈O．01）；与高糖组比较，吡格列酮组与TNK各剂量上述情况有不用程度的改善。作用效果类似。结论：糖耐康含药血清具有改善高糖环境下肝脏糖脂代谢紊乱的作用，可能与增加肝细胞胰岛素敏感性改善IR有关。一条新的柱层析纯化路径对HBsAg免疫原性的影响
摘要：摘要目的：建立一条新的毕赤酵母表达乙肝表面抗原（HepatitisBantigen，HBsAg）柱层析纯化方法，保持HBsAg结构完整性和提高免疫原性。方法：毕赤酵母发酵料液经过菌体破碎、聚乙二醇沉淀、疏水层析、超滤和凝胶分子筛精纯，收集HBsAg合格样品液适当稀释后加入铝佐荆吸附，制成乙肝疫苗半成品免疫BALB／c小鼠。结果：纯化产物经SDS-PAGE银染鉴定得单一条带，分子量在23kD左右，凝胶成像软件分析纯度超过95％；该纯化方法得到的HBsAg颗粒电镜观察得平均直径为22nm病毒样颗粒，结构较均一完整；自制疫苗免疫小鼠后，其血清抗体水平高于葛兰素史克生产的Engerix—B（安在时），存在显著性差异（P〈0．05）。结论：通过该方法纯化的HBsAg结构完整性良好，疫苗免疫效果优于酵母表达的Engerix—B，纯化路径简单高效，易于放大用于工业化生产。生长因子TGF-β1和bFGF促兔骨髓间质干细胞向韧带样细胞分化的实验研究
摘要：摘要目的：采用生长因子TGF-β1和bFGF诱导体外培养的兔骨髓间质干细胞（MSCs），转化为韧带样细胞，并研究此种韧带样细胞的生物特性。方法：自幼兔四肢骨抽取骨髓分离纯化MSCs并培养、增殖；采用特定浓度TGF-β1（10ng／ml）和bFGF（25ng／mL）对MSCs进行诱导分化，观察生长因子对MSCs生长、形态的影响，使用MTT法绘制细胞生长曲线，使用天狼腥红染色法定量对比MSCs分泌胶原蛋白量。单纯培养和单一因子诱导组作为对照。结果：TGF-β1和bFGF联合使用组，细胞形态优于空白组及单一因子组，细胞增殖率、胶原分泌量也均高于对照组。结论：联合使用生长因子TGF-β1和bFGF刺激兔MSCs，能够促使兔MSCs定向转化为韧带样细胞，对组织工程前交叉韧带的构建具有积极意义。人正常及骨关节炎软骨细胞体外培养的对照研究
摘要：摘要目的：研究人正常软骨细胞及骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养及鉴定方法，对其生物学特性进行对照并评价其生物学活性。方法：取人创伤性截肢与骨关节炎全膝置换的无菌膝关节软骨，采用两步酶消化法分离培养人关节软骨细胞，并进行传代培养。通过倒置相差显微镜下观察细胞形态，绘制生长曲线，测细胞增殖，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对细胞进行对照研究。结果：骨关节炎软骨细胞形态似成纤维细胞，生长速度明显较正常软骨细胞慢。MTT测细胞增殖显示，第2．4、6代骨关节炎软骨细胞在相同时间点大都比同代正常软骨细胞增殖速度慢（P〈0．05）。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色显示，骨关节炎软骨细胞染色较正常软骨细胞浅，经多次传代后基本无着色。结论：正常软骨细胞5代以内细胞生长良好，生物学特性明显，5代以后出现去分化现象。骨关节炎软骨细胞增殖慢，生物学特征退变旱，符合软骨细胞退变的表现。这为骨关节炎在软骨细胞水平的研究提供了实验基础。SIRT1在宫颈癌细胞耐药中的作用及其机制研究
摘要：摘要目的：探讨沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1（silentmatingtypeinformationregulation2homologyl，SIRTl）在宫颈癌化疗耐药中的作用及其机制。方法：体外培养人宫颈癌Hela细胞系和宫颈癌Hela／MMC耐药细胞亚系，westernblotting检测MMC对Hela和Hela／MMC细胞内SIRTl蛋白表达的影响；MTT法检测MMC及Nicotinamide对Hela和Hela／MMC细胞增殖的影响；AnnexinV-PI试验检测Hela／MMC细胞凋亡的亡的情况；RT—PCR方法检测耐药相关蛋白P—gP的mRNA表达情况。结果：正常情况下，Hela／MMC细胞中SIRTl的表达显著高于Hela细胞（P〈0．05），MMC处理的Hela／MMC细胞中SIRTl的表达显著高于未经MMC处理（P〈0．05）。Nicotinamide对Hela和Hela／MMC细胞具有相似的生长抑制作用，Nicotinamide可使MMC诱导的Hela／MMC细胞凋亡增加，同时降低细胞内P-gP的mRNA表达（P〈0．05）。结论：SIRTl表达下调能显著减轻Hela／MMC细胞对MMC的耐药性，其作用可能与P—gp有关。腹会阴直肠癌柱状切除术经改良后治疗低位直肠癌的30例临床效果分析
摘要：摘要目的：探讨分析改良后的腹会阴直肠癌柱状切除术治疗低位直肠癌，降低局部复发率的临床效果。方法：回顾性分析2010年1月至2012年6月入住我院并采用改进后的腹会阴直肠癌柱状切除术（CAPR）治疗低位直肠癌的患者30例，男性20例，女性10例，年龄为57＋3．8岁，肿瘤分期为T3-T4。结果：采用改进的CAPR能切除更多远端直肠周围组织；切除标本呈柱状；30例均无术中肠穿孔；会阴切口均Ⅰ期愈合；1例发生会阴血清肿；30倒均无盆底会阴疝形成；术后30例直肠环周切缘均无癌残留；术后平均随访2．1±3．1个月，均无局部复发。结论：经改进的腹会阴直肠癌柱状切除术不仅降低了手术的操作难度，扩大了直肠周围的切除范围，降低了术中直肠穿孔率和环周切缘阳性率，从而降低术后局部复发率，该术式值得在临床上进一步推广。超声造影与增强CT鉴别诊断肾实质性恶性肿瘤的临床价值比较
摘要：摘要目的：比较超声造影（CEUS）和增强CT（CECT）鉴别诊断肾实质性恶性肿瘤的临床价值。方法：将93例肾脏肿瘤患者分别给予CEUS与CECT检查，将诊断结果与病理检查结果作对照，比较两种诊断方法的敏感度、特异度和准确率。结果：两种诊断方法的特异度无显著差异，P〉0．05；而CEUS对肾脏恶性肿瘤诊断的敏感度及准确率均显著优于CECT，P〈0．05。结论：CEUS在鉴别诊断肾实质性肿瘤方面较CECT在敏感度和准确率上具有一定的优势，临床上二者联合应用可优势互补，提高肾脏肿瘤的鉴别诊断价值。复方斑蝥胶囊联合放疗治疗鼻咽癌的临床疗效分析
摘要：摘要目的：观察复方斑蝥胶囊联合放疗治疗鼻咽癌的临床效果及不良反应。方法：将2007年6月至2010年12月来我科就诊的120例Ⅱ、Ⅲ期低分化鳞状细胞鼻咽癌伴有颈淋巴结转移的患者随机分为复方斑蝥胶囊辅助放疗组、甘氨双唑钠辅助放疗组（阳性对照组）和单纯放疗组（阴性对照组），每组各40例，比较治疗后各组患者的治疗效果和不良反应。结果：各组患者在接受相同放射疗程的情况下，复方盥蝥胶囊辅助放疗组和甘氨双唑钠辅助放疗组的治疗总有效率均明显优于单纯放疗组（P〈0．05），但复方斑蝥胶囊辅助放疗组与甘氨双唑钠辅助放疗组比较无明显差异（P〉0．05）。复方斑蝥胶囊辅助放疗组皮肤反应的发生率明显低于单纯放疗组（P〈O．05）；皮肤反应、黏膜反应、口腔溃疡和心电图异常的发生率均明显低于甘氨双唑钠辅助放疗组（P〈O．05），但两组恶心呕吐的发生率比较无明显差异（P〉0．05）。结论：复方斑蝥胶囊辅助治疗可显著提高放疗治疗鼻咽癌的临床疗效，且无明显毒副作用，值得临床推广应用。C反应蛋白在结直肠癌患者中的表达及与预后的关系
摘要：摘要目的：4g讨C反应蛋白（CRr＇）在结直肠癌患者中的表达及与预后的关系。方法：采用免疫速率散射比浊法检测血清CRP，并与健康对照组进行比较，分析CRP与临床病理分期之间的关系，评价术前、术后CRP表达与预后的关系。结果：研究组术前CRP为（28．64±7．15）mg／L，术后降低为（7．83±1．03）mg／L，差异有统计学意义（P〈0．05），都高于对照组的（1．13±0．28）mg／L，差异有统计学意义（P〈0．05）。CRP表达与年龄和性别中的表达差异无统计学意义（P〉0．05），与T、N、M分期和分化程度有关（P〈0．05）。术前高、低CRP组的5年生存率分别为79．17％和95．24％，差异有统计学意义（P〈0．05）；术后高、低CRP组的5年生存率分别为85．00％和88．00％，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：结直肠癌与炎症反应密切相关，CRP在其发生、发展中发挥着重要作用，术前CRP水平对疾病的预后具有一定的预测价值。儿童过敏性紫癜的临床特点及其肾损害的相关因素分析
摘要：摘要目的：总结儿童过敏性紫癜的临床特点，并分析其肾损害的相关因素。方法：选择2006年2月~2012年8月我院小儿科诊治的过敏性紫癜患儿86例，根据是否伴有肾脏损害分为观察组（34例）和对照组（52例），分析两组患者的一般临床资料，总结儿童过敏性紫癜的临床特点，并探讨导致儿童过敏性紫癜并发肾损害的相关因素。结果：（1）儿童过敏性紫癜的诱因包括感染、过敏、疫苗接种、寄生虫病史及其它原因，其中感染比例最高，占66．28％；首发症状包括紫癜、腹痛及关节痛的一种或多种，其中紫癜比例最高，占59．30％。（2）观察组患儿中年龄≥8Y、皮疹反复≥4w及血FIB升高的比例分别为73．53％（25／34）、52．94％（18／34）和26．47％（9／34），均显著高于对照组患儿（P〈0．05），非条件Logistic多元回归分析结果示皮疹反复≥4W及血FⅢ升高为过敏性紫癜患儿发生肾脏损伤的危险因素。结论：儿童过敏性紫癜的主要诱因为感染，典型临床表现为紫癜，皮疹反复芝4w及血FIB升高为过敏性紫癜患儿发生肾脏损伤的危险因素。亚低温治疗急性重度颅脑损伤120例临床疗效分析
摘要：摘要目的：研究亚低温治疗对于急性重度颅脑损伤临床疗效。方法：将226例急性重度颅脑损伤患者随机分为治疗组与对照组。治疗组120例，对照组106例。对照组采用颅脑损伤常规治疗。治疗组在对照组基础上加用亚低温治疗。观察两组患者治疗前后颅内压、血糖变化。对比两组患者治疗前后GCS评分、GOS评分及不良反应发生率。结果：治疗组于治疗1d、3d及7d时颅内压与血糖值均明显低于对照组（P〈0．01）。治疗3个月时治疗组平均GCS评分明显高于对照组（P〈0．01）；治疗组恢复良好比例高于对照组（P〈O．05），而死亡率低于对照组（P〈0．05）。两组患者治疗不良反应发生率无明显区别（P〉0．05）。结论：采用亚低温疗法有助于辅助降低急性重度颅脑损伤患者颅内压及血糖，保护脑细胞，改善患者预后，降低死亡率。老年高血压合并高脂血症并发缺血性心脏病患者的相关危险因素分析
摘要：摘要目的：探究老年高血压合并高脂血症并发缺血性心脏病患者的相关危险因素。方法：对我院2008年5月一2011年11月收治的老年高血压患者进行回顾分析，将合并高脂血症及缺血性心脏病患者纳入观察组，其余患者纳入对照组，对年龄、家族史等临床资料进行危险因素回归分析，总结其相关危险因素。结果：单因素分析发现，年龄、家族史、肥胖、糖尿病等9项因素存在统计学差异，将其纳入多因素COX模型分析，发现年龄、吸烟史、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、高水平C反应蛋白及高尿酸血症是影响老年高血压合并高脂血症并发缺血性心脏病的独立危险因素。结论：年龄、吸烟史、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、高水平C反应蛋白及高尿酸血症是影响老年高血压合并高脂血症并发缺血性心脏病的独立危险因素，对于存在危险因素的患者应及时进行早期干预，防止严重并发疾病的出现。
