14-3-3σ干扰逆转录病毒载体的构建及其稳定转染HaCat细胞系的建立
摘要：目的：构建14-3-3σ干扰逆转录病毒载体,建立稳定转染的HaCat细胞系。方法：人工合成14-3-3σ基因干扰序列并定向插入到pSuper-retro-neo-EGFP质粒,并在STBL3菌内进行质粒扩增,刷选阳性克隆,酶切测序鉴定,转染293FT细胞进行病毒包装、扩增、纯化、获取逆转录病毒载体,将逆转录病毒载体感染HaCat细胞后Western免疫印迹法、Real-timePCR法检测14-3-3σ的表达情况。结果：连接重组后经酶切和测序筛选出pSuper-retro-neo-EGFP-si14-3-3σ;干扰质粒稳定转染的HaCat细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光,Western免疫印迹法和Real-timePCR法表明14-3-3σ表达明显抑制。结论：成功构建了14-3-3σ干扰的逆转录病毒载体,并构建了其稳定转染的HaCat细胞系。抑癌候选基因NDRG2对结肠癌细胞SW620的迁移和侵袭力的影响
摘要：目的：观察NDRG2对结肠癌SW620细胞侵袭、转移等生物学行为的影响,探讨其可能的调节机制。方法：用阳离子脂质体转染方法分别转染pcDNA3.1-Ndrg2和SiRNA-Ndrg2于SW620细胞内48h,上调/下调NDRG2的表达;检测NDRG2基因mRNA及蛋白表达水平的变化;通过划痕试验及transwell细胞侵袭试验进一步对上调/下调NDRG2表达水平后的结肠癌细胞迁移和侵袭能力进行分析。结果：pcDNA3.1-Ndrg2转染SW620后,NDRG2的mRNA和蛋白表达水平明显升高,细胞的迁移和侵袭能力下降;SiRNA-Ndrg2转染SW620后,NDRG2的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞的迁移和侵袭能力上升,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论：NDRG2作为抑癌候选基因能够降低结肠癌细胞转移和侵袭能力。三硝基苯磺酸法测定聚乙二醇化重组人生长激素的平均修饰度
摘要：目的：建立测定三种不同结构聚乙二醇化重组人生长激素（PEG-rhGH）平均修饰度的三硝基苯磺酸法（TNBS）。方法：采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF）测定PEG-rhGH的分子量,求得理论平均修饰度。既而通过正交试验、游离PEG干扰等方法学考察,建立TNBS法。结果：从质谱法可知PEG-rhGH的理论修饰度为10%,TNBS法测得三种PEG-rhGH的修饰度分别为为10%、12%及10%,与理论值相符。结论：TNBS操作简单,不需要专门的仪器,可作为测定PEG-rhGH平均修饰度的方法。瑞舒伐他汀对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化中调节性T细胞的影响
摘要：目的：探讨瑞舒伐他汀对载脂蛋白E基因敲除（ApoEKO）小鼠动脉粥样硬化中调节性T细胞的影响。方法：首先将30只ApoEKO小鼠建立动脉粥样硬化模型,随机分为高胆固醇饮食组（对照组）、瑞舒伐他汀低剂量组和瑞舒伐他汀高剂量组,各组分别给予蒸馏水或瑞舒伐他汀进行干预8周;将主动脉根部行冰冻切片油红染色,评估粥样硬化斑块面积大小;免疫组织化学法检测主动脉根部粥样硬化斑块处调节性T细胞（Treg）的表达。结果：各组小鼠均有动脉粥样硬化斑块形成,采用瑞舒伐他汀治疗的小鼠动脉粥样硬化斑块的面积明显小于未经治疗的小鼠（P〈0.01）,同时瑞舒伐他汀能明显增加粥样硬化病变处调节性T细胞的表达,且呈现剂效关系。结论：本实验观察到瑞舒伐他汀不仅能减小ApoEKO小鼠的主动脉粥样硬化斑块,且能使调节性T细胞的表达增多,推测瑞舒伐他汀可以通过促进调节性T细胞的生成而起到抑制动脉粥样硬化的作用。转hGM-CSF基因HepG2细胞疫苗侵袭性和生长活性初步检测
摘要：目的：探讨经60Co处理的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗的侵袭性和生长活性变化。方法：体外培养三种肝癌细胞（①野生型HepG2肝癌细胞②转染hGM-CSF基因的HepG2肝癌细胞③60Co射线处理的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗）采用MTT方法检测三种细胞在24h、48h、72h的OD值并绘出生长曲线;利用transwell小室进行体外侵袭实验来观察上述三种细胞侵袭性;用RT-PCR技术检测上述三种细胞基质金属蛋白酶2（MMP-2）在mRNA水平上表达的变化;结果：经60Co照射处理的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗组OD值在相同培养时间点较其他两组明显变小且差异有显著性（P〈0.05）。三种细胞（上述①②③种细胞）transwell侵袭试验显示：③组穿过人造基底膜的细胞数量明显少于前两组;PT-PCR示：③组细胞的MMP-2的mRNA的表达明显低于①②。结论：经过60Co处理过的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗的侵袭性和生长活性均明显降低。针对miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与检测
摘要：目的：构建携带人miR-221基因的miRNA干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法。方法：合成含干扰序列的双链DNAoligo直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR鉴定,阳性克隆即为目的基因RNA干扰慢病毒载体质粒。再将目的基因与目的载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T细胞,用westernbolt法检测其有效敲减靶序列。结果：重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576的靶点干扰效果最好。结论：本实验成功构建了人miR-221基因的RNA干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列。花生RG段的克隆及初步分析
摘要：目的：通过同源克隆获得了花生闽花6号的RG段,为其抗性的研究及抗性育种提供了参考资料。方法：试验分为两组：其一通过利用抗性基因的NBS保守区所设计的简并引物对花生品种闽花六号进行了RG段扩增,其二结合已登录的花生RG段序列经过多元比对后设计简并引物进行RG段的扩增及序列分析;分析比较两组克隆方法的效果。结果：测序分析表明：前者20条随机测序序列中没有一条与已知RG段序列相似;后者20条随机测序序列中有18条为RG段序列,其登录号为GenBankEU639668-EU639685。结论：前一种方法克隆扩增RGA基因片段的效率很低,而后一种方法克隆扩增效果更好,这为闽花6号花生的遗传改良提供了理论基础。叶酸介导的普鲁兰多糖-阿霉素聚合物前药的制备及生物学性能初探
摘要：目的：制备叶酸介导的普兰多糖-阿霉素聚合物前药（FA-MP-DOX）,实现阿霉素药物的靶向控制释放。方法：将普鲁兰多糖用马来酸酐进行修饰后,通过酰胺键键合阿霉素制备得到普鲁兰多糖-阿霉素（MP-DOX）,继而酯键键合叶酸制备得到叶酸介导的普鲁兰多糖-阿霉素聚合物前药（FA-MP-DOX）。红外光谱、核磁共振光谱表征聚合物药物的结构,动态透析法模拟体外释药特性,监测不同pH值聚合物药物中阿霉素的释药特性,同时采用人口腔表皮样癌细胞（KB细胞）测定聚合物药物体系的细胞毒性。结果：①经核磁共振表征FA-MP-DOX聚合物合成完成。②在pH2.5、pH5.0及pH7.4的PBS缓冲体系16h中,阿霉素药物累积释放率分别为49.1%,30.3%和15.3%,证实FA-MP-DOX中阿霉素的释放具有pH依赖性。③细胞实验证实FA-MP-DOX的细胞毒性高于阿霉素和MP-DOX。结论：FA-MP-DOX聚合物药物有望成为阿霉素智能型控释和靶向性药物载体。双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3的构建与鉴定
摘要：目的：构建与鉴定骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3。方法：首先,用PCR方法从质粒pGEMT/BMP2中扩增出BMP2基因全长,并将其连入双基因真核表达载体pIRES,得到质粒pIRES-BMP2,其次,从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以反转录的cDNA为模板,PCR扩增出TGFβ3基因全长,将TGFβ3基因连入质粒pIRES-BMP2;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定。结果：酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确。结论：成功构建PIRES-BMP2/TGFβ3双基因真核表达载体。清胰汤对大鼠急性坏死性胰腺炎IL-6,IL-10及肠道通透性影响
摘要：目的：探讨清胰汤改善大鼠急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis）ANP炎症反应及肠道通透性功能的治疗效果及机制。方法：将72只雄性SD大鼠随机分为3组,其中2组大鼠采用从胰腺被膜下多点缓慢均匀注入3.8%牛黄胆酸钠（0.5ml/100g）建立大鼠急性坏死性胰腺炎模型,再分为急性坏死性胰腺炎常规治疗组（A组）、清胰汤干预治疗组（B组）,其他24只大鼠为假手术组（S组）,每组再随机分为24h、48h、72h组。各组于12h后给于肠内营养,B组肠内营养后给于2次清胰汤2.5ml/100g,A组、S组给于同等剂量生理盐水。各组于建模后24h、48h、72h处死,腹腔动脉取血检测血清淀粉酶浓度、IL-6、IL-10、D-乳酸水平。结果：48h时点B组IL-10水平较A组高（P〈0.05）;72时点B组血清淀粉酶水平较A组低（P〈0.01）,IL-6水平较A组低（P〈0.01）,IL-10水平较A组高（P〈0.01）,D-乳酸水平较A组低（P〈0.01）。结论：清胰汤可以上调IL-10改善大鼠急性胰腺炎炎症反应从而降低肠道通透性。bFGF/BMP/胶原膜加速颌骨骨折愈合的大体及X线观察
摘要：目的：了解胶原膜作为生长因子缓释材料治疗颌骨骨折的应用前景。方法：将100μg的rhBMP-2用1ml的bFGF溶液完全溶解;用移液器移出40μl的该溶液,滴加到面积为0.5cm×1cm的胶原膜组织块中,冻干后制成生长因子缓释系统;在12只新西兰大白兔两侧制成人工下颌骨骨折模型,左侧置放bFGF/BMP/胶原膜;右侧均为空白对照;术后2、4、12周行临床大体观察及X线片观察。结果：实验组骨折愈合速度明显快于对照组。术后2周,X线结果显示bFGF/BMP/胶原膜组骨折断端边缘模糊。对照组骨折线明显。术后4周,X线结果显示bFGF/BMP/胶原膜骨折线基本不可见,骨折对位良好,断端边缘基本消失,骨折无错位。对照组骨折下缘可见纤维性骨痂形成,骨折线模糊。术后12周,各组X线结果无差异,骨折部位接近正常骨组织。结论：bFGF/BMP/胶原膜能加速骨折愈合,提高骨折愈合效果。明日叶查尔酮对小鼠肝癌细胞PCNA和BCL-2蛋白表达影响
摘要：目的：研究明日叶（Angelica keiskei Koidz）查尔酮对小鼠肝癌细胞PCNA和BCL-2蛋白表达的影响。方法：将50只皮下接种肝癌H22细胞株的小鼠随机分为5组,每组10只。高、中、低剂量组分别每日经口灌胃给予40、20、5mg/kg的查尔酮,肿瘤对照组给予等量生理盐水,连续10d,环磷酰胺组隔天腹腔注射环磷酰胺20mg/kg。取肝癌组织用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法测各组小鼠肝癌细胞增殖活性,免疫组化法检测各组肝癌细胞增殖细胞核抗原（PCNA）和凋亡相关蛋白BCL-2表达水平。结果：高剂量查尔酮组和肿瘤对照组的肝癌细胞增殖活性分别为（0.716±0.018）和（1.135±0.032）,差别有显著性（P〈0.05）。高剂量组PCNA和BCL-2蛋白表达率分别为28.33%和16.77%,肿瘤对照组分别为72.77%和65.17%,差异均有显著性（P〈0.05）。结论：查尔酮可降低小鼠肝癌细胞PCNA和BCL-2表达水平,对肝癌细胞增殖有一定抑制作用。结缔组织生长因子在慢性阻塞性肺疾病血管重建中表达研究
摘要：目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）在慢性阻塞性肺疾病（COPD）血管重建中的表达及意义。方法：将30例有吸烟史的男性鳞癌需要手术的患者按其肺功能结果分成二组,对照组：（肺功能正常组）;COPD稳定期组：（肺功能异常组）,每组15例,标本来自于癌旁的肺组织,肺血管重塑的形态学观察行HE和MASSON三色染色,行免疫组化来观察CTGF蛋白、PCNA蛋白在肺血管平滑肌中的表达。结果：（1）COPD组肺动脉管壁面积/管总面积（WA%）、管壁的胶原厚度、肺动脉平滑肌中CTGF蛋白及PCNA蛋白的表达与对照组相比差异有统计学意义。（2）CTGF与管壁面积/管总面积（WA%）、管壁的胶原厚度及血管平滑肌中PCNA表达呈正相关（,r值分别为0.81、0.68、0.86,P〈0.05）。吸烟指数与管壁面积/管总面积及PCNA的表达呈正相关（r=0.73,0.99,P〈0.01）。结论：单纯吸烟者即有血管重建,吸烟伴COPD者血管重建更加严重,CTGF在COPD患者肺血管中的表达较对照组高,可能参与了COPD血管重建过程。二苯乙烯苷抑制过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡
摘要：目的：研究二苯乙烯苷（TSG）对过氧化氢（H2O2）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡的保护作用。方法：运用四甲基偶氮唑盐还原法（MTT法）和流式细胞术筛选建立细胞凋亡模型的H2O2合适浓度以及检测不同浓度TSG对H2O2诱导HUVECs的增殖率和凋亡率;Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态。结果：MTT及流式法筛选300μmol/L为H2O2作用于细胞的最适凋亡浓度。MTT和流式结果显示,与H2O（2300μmol/L）损伤组比较,10μmol/L与100μmol/LTSG预处理组细胞的增殖率增加（P〈0.05）,凋亡率显著降低（P〈0.01）;Hoechst33258染色观察TSG能降低H2O2诱导的细胞凋亡,使细胞凋亡数减少。结论：TSG能抑制H2O2诱导的HUVECs凋亡,从而起到保护血管内皮细胞的作用。直接注射法制作ICR小鼠肝癌原位移植瘤模型
摘要：目的：培养鼠肝癌H22细胞,直接注射法制作ICR小鼠肝癌原位移植瘤,为后续实验奠定基础。方法：鼠肝癌H22细胞体外培养,将调整好的对数生长期的肝癌细胞直接注射小鼠肝脏,2周后解剖观察,并进行组织HE染色。结果：所有实验小鼠均可见肿瘤生长,HE染色示肝细胞肝癌。结论：直接注射法制作ICR小鼠肝癌原位移植瘤模型简便易行,值得推广应用。负载金属离子的5A沸石的体外抗菌实验
摘要：目的：探讨负载金属离子的5A沸石的体外抗菌作用。方法：选用金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、白色念珠菌,利用倍比稀释法对5A沸石组、磺胺嘧啶银组及载不同浓度Ag＋、Zn2＋5A沸石共15组进行了体外抗菌试验研究,确定最佳抗菌效果离子负载方案。结果：三种细菌的MIC,双金属离子负载在抗菌上具有协同载Ag＋5A沸石分别达到了125μg/ml~500μg/ml、31.25μg/ml~500μg/ml、250μg/ml~500μg/ml;附载Zn2＋5A沸石分别达到了12.5mg/ml~25mg/ml、6.25mg/ml~50mg/ml、25mg/ml;负载双离子5A沸石分别为250μg/ml~500μg/ml、62.5μg/ml~500μg/ml、500μg/ml。结论：5A沸石负载金属离子后均具有抗菌作用,且抗菌作用与附载金属离子的量正相关;负载相同质量Ag＋的5A沸石较附载Zn2＋者具有更强的抗菌作用;双金属离子负载在抗菌上具有协同作用;2%Ag＋＋8%Zn2＋与2%Ag＋＋10%Zn2＋及4%载银组与阳性对照组无显著性差异。牛肠激酶催化亚基工程菌培养条件的探索与鉴定
摘要：目的：探索牛肠激酶催化亚基工程菌高效表达的培养条件。方法：牛肠激酶催化亚基基因的初步表达,筛选构建工程菌,从以下方面入手优化培养条件：培养基的组成、摇瓶发酵培养条件、培养基的PH、种龄、接种量、培养时间等,并且通过Western Blotting和SDS-PAGE等鉴定不同条件下的实验结果,从而确定最佳培养条件。结果：通过鉴定实验结果,从不同种平行培养条件中选择产量最高的培养条件,作为最优培养条件。结论：成功地探索并鉴定了工程菌的适宜培养条件。干扰素γ和白介素10在慢性乙型重型肝炎中的变化
摘要：目的：探讨INF-γ和IL-10在慢性乙型重型肝炎中的作用。方法：搜集不同患者血样,提取血清,使用ELISA方法检测不同患者不同时期的血清INF-γ和IL-10水平,并进行相关统计。结果：本研究发现,和其它肝炎对照组及健康对照组相比,慢性乙型重型肝炎患者的血清INF-γ水平显著升高,IL-10水平显著降低。尽管在不同预后的患者中,INF-γ水平差异并不明显,但是随着治疗生效,INF-γ水平会出现明显的下降。结论：慢性乙型重型肝炎和其它慢性肝炎相比,INF-γ和IL-10表达存在着差异,而且INF-γ可能是一种比较有效的监控慢性重型肝炎病程以及疗效的指标。
