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色谱 2010年第02期杂志 文档列表

色谱杂志特别策划：色谱技术在蛋白质组学研究中的应用

引言107-107

摘要：蛋白质组是指一个有机体的基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是研究有机体蛋白质的组成及其变化规律的科学。蛋白质组成的高度复杂性和随时间、空间变化的特点，对蛋白质组的研究技术和方法提出了巨大挑战。色谱作为现代分离科学的核心技术之一，在蛋白质组研究中发挥了重要作用。

基于共价色谱分离的含半胱氨酸肽段富集策略108-114

摘要：多维色谱分离、串联质谱分析技术已在蛋白质组研究中得到广泛应用。然而生物样品的蛋白质以及全酶切肽段具有高度的复杂性,这严重干扰了蛋白质高通量、规模化的分析。通过标签肽段富集进行样品预分离可以降低体系的复杂程度。本文建立了一种基于共价色谱技术选择性分离富集含半胱氨酸肽的方法,从而降低了样品体系的复杂程度。首先以牛血清白蛋白（BSA）的酶切肽段为模型,对富集条件进行了优化和考察,并在此基础上通过5种蛋白质酶切肽段混合物的富集对该方法进行了验证。结果证明此方法的重现性好,富集效率高,富集特异性好,能有效地富集鉴定含半胱氨酸肽段。所建立的方法在复杂体系的蛋白质组研究中具有广泛的应用前景,为复杂样品的蛋白质高通量、自动化、规模化鉴定和定量研究提供了实用技术。

多维离子交换色谱分离和串联质谱鉴定在小鼠肝脏膜蛋白质组分析中的应用115-122

摘要：膜蛋白质在变性剂作用下能够较充分地溶解。根据这一特点,我们试图在变性剂溶液中采用串联离子交换色谱法分离小鼠肝脏膜蛋白质。将小鼠肝脏膜蛋白质溶解于含有4mol/L尿素,20mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲液（pH9.0）中,用Q-SepharoseFF和SephacrylS-200HR树脂组成的色谱柱结合大部分溶解的膜蛋白质,然后采用氯化钠线性梯度洗脱蛋白质,分步收集后采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进一步分离洗脱组分的蛋白质。利用胶内胰蛋白酶消化技术将SDS-PAGE胶内分离的蛋白质降解为相应的肽段,然后以反相高效液相色谱分离和离子阱质谱仪鉴定肽段。根据文献报道和蛋白质的功能分类,在所鉴定的392个蛋白质中有306个可能为膜蛋白质或膜结合蛋白质。蛋白质的疏水性计算表明,GRAVY（grandaverageofhydropathicity）得分大于或等于0.00的蛋白质有83个。综上所述,我们有理由认为本实验方法基本符合小鼠肝脏膜蛋白质组学研究的要求。

Ti-SBA-15介孔材料用于磷酸化肽的高效富集123-127

摘要：结合基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）检测技术,考察了Ti-SBA-15介孔材料对β-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的选择性富集性能。实验结果显示,含Ti和Si物质的量比为0.08的Ti-SBA-15介孔材料可选择性地对β-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽进行选择性富集;对于β-酪蛋白和牛血清白蛋白物质的量比为1：100的蛋白质酶解混合液,Ti-SBA-15仍能实现对其磷酸化肽的有效富集。上述结果表明,作为一种多孔、高比表面积的磷酸化多肽的选择性吸附材料,Ti-SBA-15有望在磷酸化蛋白质组的分析中得到广泛的应用。

色谱保留时间在蛋白质组研究中的应用128-134

摘要：液相色谱与串联质谱联用（LC-MS/MS）技术是蛋白质组学研究中的常见方法。保留时间作为独立于质谱信息的参数已经被用于蛋白质的鉴定和定量工作中。在多肽鉴定领域,多肽的色谱保留时间预测与常规的二级串联质谱数据库搜索算法结合可以提高鉴定的可信度。鉴定的灵敏度也可以通过匹配多次LC-MS实验中具有相同精确质量数和保留时间的峰而提高。另一方面,由于色谱条件的微小改变即会引起保留时间的变化,因此对多次实验结果进行保留时间比对是进行非标记定量的不可或缺的步骤。另外,联合保留时间偏移和质量数信息还可以进行蛋白质翻译后修饰（post-translational modification,PTM）的鉴定。

基质辅助激光解吸电离质谱和电喷雾电离质谱在辣根过氧化物酶糖肽结构分析中的应用135-139

摘要：糖链结构的质谱解析是今后糖蛋白分析中的重要研究内容,其中完整糖肽的分析,由于可以同时获得糖基化位点和对应糖链的结构信息,更具有重要意义和研究前景。本工作对质谱软电离技术在完整糖肽分析中的应用进行了研究,其中包括了基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI）和电喷雾电离（electrospray ionization,ESI）技术。通过平行使用两种串联质谱（tandem mass spectrometry,MS/MS）分析策略：MALDI-MS/MS和ESI-MS/MS对目标糖蛋白--辣根过氧化物酶进行分析,并讨论了其互补性。结果表明,MALDI和ESI技术各有优劣,结合串联质谱分析,可获得糖肽的糖链结构信息;两条路线互补使用,在揭示蛋白质糖基化修饰（位点和结构）的研究中十分必要。

毛细管整体柱在线二维分离系统应用于人体软骨的蛋白质组分析140-145

摘要：将已建立的7cm柱长的磷酸基团强阳离子交换富集整体柱与85cm柱长的C12烷基反相整体柱结合的在线二维分离平台应用于软骨提取蛋白的蛋白质组分析。对20μg软骨提取蛋白的酶解产物进行14个盐梯度的分级,然后对14个馏分进行反相色谱梯度分离及串联质谱鉴定,成功地鉴定得到了7434个独立肽段对应的1901个非冗余蛋白质。对所鉴定到的蛋白质进行定位分类,结果表明鉴定到的大部分蛋白质是来自于软骨细胞内部的低丰度蛋白质,这对于许多关节类疾病的研究有重要意义。

基于在线二维色谱的不同生长时期鹿茸的比较蛋白质组分析146-151

摘要：建立了基于在线二维弱阴离子交换色谱-反相液相色谱（2D-WAX-RPLC）的蛋白质分离系统,并用于不同生长时期鹿茸的比较蛋白质组分析。以5种标准蛋白质的混合物为样品,考察了系统的重现性。通过改变标准蛋白质之间的浓度比,研究了该系统进行蛋白质相对定量的能力。在此基础上,针对4个不同生长时期的鹿茸样品,分别采用5种不同的方法进行蛋白质提取,经2D-WAX-RPLC分离后,收集各生长时期对应蛋白质的峰高最大比超过2的组分。酶解后,采用微柱反相液相色谱-串联质谱（μRPLC-MS/MS）进行肽段的分离鉴定;共从9个差异蛋白质峰中鉴定到了22个差异蛋白质。研究结果表明,利用基于蛋白质水平的在线二维液相色谱分离技术找寻差异蛋白质,具有重现性好、自动化程度高等优点,可用于开展比较蛋白质组学的研究。

天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂在二氧化钛选择性富集磷酸肽中的应用152-157

摘要：二氧化钛富集法作为目前使用最为广泛的金属氧化物富集磷酸肽的方法,在富集过程中常常对富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性非磷酸化肽段存在一定的非特异性吸附作用。这些肽段与磷酸化肽段一同被富集,降低了磷酸肽富集的选择性。传统方法中使用的非特异性吸附抑制剂常会对质谱的电喷雾离子源造成污染,因而限制了其在液相色谱-质谱联用（LC-MS）系统中的应用。本研究将天冬氨酸作为一种新型的非特异性吸附抑制剂加入到二氧化钛富集体系中,并分别对3种和9种标准蛋白质酶切肽段混合物进行富集实验,同时与添加另一种非特异性吸附抑制剂——谷氨酸以及不添加任何非特异性吸附抑制剂的富集体系进行了富集效果的比较。结果表明,天冬氨酸可以有效地提高二氧化钛对磷酸肽富集的选择性。将添加天冬氨酸的二氧化钛富集体系应用于鼠肝全蛋白质磷酸肽的富集中,同样取得了很好的效果,表明天冬氨酸在复杂的生物样本的磷酸肽富集中也同样具有良好的应用前景。此外,由于天冬氨酸在反相色谱中极易被洗脱去除,从而避免了传统抑制剂对LC-MS系统离子源的污染问题。

全国生物医药色谱学术交流会（2010）（第二轮通知）157-157

摘要：由中国化学会色谱专业委员会和北京理化分析测试技术学会北京色谱学会主办，中国科学院化学研究所和北京理化分析测试技术学会承办的“全国生物医药色谱学术交流会（2010）”定于2010年5月7—11日在江西省景德镇市召开。

蛋白质高效分离两维色谱柱的选择优化158-162

摘要：为了构建高效的离子交换/反相二维液相色谱（IEC/RPLC）分离平台系统,提高复杂蛋白质样品的分离效率,对色谱柱进行了评价与筛选。通过对实际人肝蛋白质样品的分离效果的比较,选择确定了TSKgelDEAE-5PW弱阴离子交换色谱柱（WAX）作为第一维色谱分离柱;考察了同一规格的10支代表性反相色谱柱（250mm×4.6mm,5μm,30nm,C4、C8或C18）,通过评价其对尿嘧啶、硝基苯、萘和芴的分离性能以及对3种标准蛋白质样品的非特异性吸附、对人肝蛋白质样品的WAX馏分的分离效果,最终确定以Jupiter300 C4反相色谱柱作为第二维色谱分离柱。对两维色谱柱的选择优化为蛋白质高效分离二维液相色谱平台的搭建提供了可靠基础。

二维液相色谱接口的改进及其在蛋白质组学研究中的应用163-167

摘要：随着蛋白质组学、本草物质组学等组学概念的提出,所需分析的样品的成分越来越复杂,因此具有强大分离能力的多维液相色谱技术受到人们越来越多的关注。二维液相色谱中第二维的分离性能和速度是整个分离系统性能的关键。基于捕集柱模式,我们采用经特殊设计的流路系统,使得双捕集柱型接口具有预分离的功能。样品从第一维流出以后被富集在捕集柱1的柱头,经过脱盐后,正冲捕集柱,捕集柱1与第二维色谱柱联用对富集的样品进行分离,增加了第二维分离效率。当捕集柱上的样品全部被洗脱到第二维色谱柱上时,捕集柱2已经完成对第一维洗脱液中样品的捕集和脱盐,此时将阀进行切换,捕集柱2与第二维色谱柱直接相连进行洗脱。循环切换捕集柱1和捕集柱2,维持较高的阀切换频率,实现了第二维色谱柱的连续洗脱。因此保证了第二维分离具有较快速度,同时具有较高的分离效率。使用35mm长捕集柱和十通阀为接口,以弱阴离子交换（WAX）色谱为第一维分离模式,以反相（RP）色谱为第二维分离模式,构建了WAX-RP二维液相色谱系统（2D-LC system）。以小鼠血清为样品对系统进行了初步评价。色谱流出曲线出现了明显的界面现象,这是由于捕集柱流动相中含有的较多盐分流出时的背景吸收造成的。同时,由于界面两侧的流动相黏度不同产生了黏性指进（VF）现象。当第二维色谱柱长度为50mm时,理论上可将第二维分离效能提高70%。该接口可以应用于多种二维液相色谱模式,适用于蛋白质组学和本草物质组学研究中对于复杂样品的分离分析。

色谱杂志专论与综述

涡流色谱技术在生物样品分析中的应用168-174

摘要：生物样品的复杂性使其在进行分析测定前必须经过处理。传统的样品前处理方法（如液-液萃取、固相萃取等）耗时长且操作繁琐。涡流色谱作为在线萃取技术,可以实现生物样品直接进样,减少了样品处理步骤,有效富集纯化了分析物,是一种高通量、高选择性的生物样品前处理方法。为此,本文介绍了涡流色谱技术的原理及优势,并总结了不同涡流柱的特点及其在生物样品分析领域中的应用情况。

色谱杂志研究论文

正交试验法优化制备用于小分子物质分离的聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯）型整体柱175-179

摘要：以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）为单体,二乙烯基苯（DVB）为交联剂,以环己醇和正十二醇为致孔剂,过氧化苯甲酰（BPO）为引发剂,直接以50mm×4.6mm色谱柱为模具,通过原位聚合制备聚（GMA-DVB）型整体柱。以GMA和DVB的体积比、环己醇和十二醇的体积比以及BPO占聚合物的质量分数为三因素,以分离苯和乙苯等小分子物质时的半峰宽分离度（R1/2）为考察指标,进行三因素三水平的正交试验,通过测定整体柱的比表面积、孔径和孔容分布对其进行表征。结果表明,制备整体柱的最优配方为V（GMA）：V（DVB）：V（环己醇）：V（正十二醇）=0.825：0.825：1.32：2.03,BPO的质量分数为0.7%。应用所制备的整体柱分离苯和乙苯等小分子物质,理论塔板数达到37000塔板/m,R1/2值达到7.14,完全达到基线分离,分离时间小于10min。该方法制备整体柱的重复性好,柱效较高,基本满足商品化要求。

高效液相色谱-基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱分离鉴定牛乳铁蛋白素180-184

摘要：建立了高效液相色谱-基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS）分离鉴定牛乳铁蛋白素（bovine lactoferricin,LfcinB）的方法。采用胃蛋白酶酶解牛乳铁蛋白,酶解液离心后取上清液,经过离子交换色谱、反相液相色谱、透析等技术分离,对分离得到的目标产物进行抗菌活性分析、蛋白含量测定和MALDI-TOF/TOF MS鉴定。分离得到高活性的LfcinB,其相对分子质量为3124.89,蛋白含量为18.20μg/mL。本方法具有精度高、分析速度快和分辨能力强等优点,是其他传统的分析鉴定LfcinB方法所无法比拟的,为进一步研究LfcinB奠定了基础。

高效液相色谱-串联质谱法测定泡沫灭火材料及其他材料中的全氟辛烷磺酸及其盐185-189

摘要：建立了一种高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）测定泡沫灭火材料、洗涤剂以及织物整理剂中全氟辛烷磺酸及其盐（PFOS）的方法。对应产品中的PFOS用水超声提取后,经固相萃取柱淋洗萃取,萃取液以乙腈-10mmol/L乙酸铵溶液（80：20,v/v）为流动相进行HPLC分离,在负离子模式和多级反应监测（MRM）方式下进行测定。用两个子离子的相对丰度定性,外标法定量。PFOS的测定在0.002～0.1mg/L范围内线性关系良好（r2=0.998）;泡沫灭火材料、洗涤剂以及织物整理剂中PFOS的加标回收率分别为93.4%～103%,93.2%～102%和91.8%～102%,精密度（以相对标准偏差（RSD）计）分别为0.48%～3.52%,0.78%～1.79%和0.47%～3.47%;方法的检出限均为2mg/kg（0.0002%）（信噪比（S/N）≥10）,满足欧盟法规对泡沫灭火材料、洗涤剂以及织物整理剂中PFOS的限量检测要求。该方法准确度和灵敏度高,前处理简单,可用于泡沫灭火材料、洗涤剂以及织物整理剂中PFOS的检测。

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鱼制品中残留的7种性激素190-196

摘要：以电喷雾离子源（ESI）为电离源,在正离子采集模式下建立了鱼制品中7种性激素（甲基炔诺酮、甲基睾酮、丙酸睾酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、诺龙）的超高效液相色谱-质谱/质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。样品被酶解后用甲醇提取,提取液经氯化锌（ZnCl2）去脂、LC-C18和LC-NH2固相萃取柱净化、WatersAC-QUITYTMUPLCBEH-C18色谱柱（100mm×2.1mm,1.7μm）分离,在多反应监测模式下进行UPLC-MS/MS分析。7种性激素的方法检出限（S/N=3）为0.08～0.17μg/kg,定量限（S/N=10）为0.24～0.58μg/kg。考察了内标法和基质匹配外标法对7种性激素进行定量的回收率与精密度：添加水平为1,4μg/kg时,以内标法定量,7种性激素的平均回收率为76%～118%,相对标准偏差（RSD）为5.0%～11.3%;以基质匹配外标法定量,7种性激素的平均回收率为66%～94%,RSD为4.5%～10.7%。该结果表明两种方法均能够满足鱼制品中7种性激素的多残留检测要求。应用建立的方法对市售脱脂大黄鱼及烤鱼片进行检测,未发现7种目标违禁性激素。

高效液相色谱-离子阱质谱法测定生物体液中的痕量敌鼠和氯敌鼠197-203

摘要：建立了中毒应急检测样品生物体液内痕量敌鼠和氯敌鼠的高效液相色谱-离子阱质谱定性定量检测方法。全血样品由甲醇/乙腈（50/50,v/v）沉淀蛋白后再经OasisHLB固相萃取小柱净化富集,尿液样品直接经同类小柱净化富集。采用ExtendC18柱分离,以乙酸铵-乙酸（0.02mol/L,pH5.5）缓冲溶液和甲醇（15/85,v/v）溶液为流动相,使用电喷雾电离负离子多反应监测模式检测敌鼠和氯敌鼠。对全血样品,敌鼠和氯敌鼠分别在1.0～200.0μg/L和0.5～100.0μg/L范围内呈良好的线性关系,回收率分别在90.1%～92.2%和87.6%～93.4%范围内,日内相对标准偏差（RSD）分别小于6.8%和7.1%,日间RSD分别小于9.9%和10.9%,定量限分别为1.0μg/L和0.5μg/L。对尿液样品,敌鼠和氯敌鼠分别在0.2～40.0μg/L和0.1～20.0μg/L范围内呈良好的线性关系,回收率分别在90.1%～94.5%和90.0%～98.0%范围内,日内RSD分别小于6.1%和7.3%,日间RSD分别小于8.9%和11.2%,定量限分别为0.2μg/L和0.1μg/L。本方法简便、灵敏,能满足敌鼠和氯敌鼠中毒病人的临床快速诊断要求。