全基因组表达谱芯片研究人着床前胚胎的发育
摘要：人着床前胚胎发育的机制目前尚不明确,这是由于研究材料的缺乏以及相关技术困难所造成的。然而,人胚胎早期发育与干细胞研究、表观遗传和再生医学都是密切相关的。此外,人的着床前胚胎的正常发育也和辅助生殖的成功率有密切联系。本研究的对象是受精后第3天和第6天的人早期胚胎。利用RNA扩增技术,得到了单个胚胎的全基因组表达谱数据。通过比较这两个不同发育阶段的表达谱数据,我们发现了与滋养层形成密切相关的基因和信号通路的显著变化,这些变化与小鼠滋养层形成的关键基因和信号通路一致,提示人和小鼠在滋养层形成的分子机制上可能是保守的。茂原链霉菌DSM 40847全基因组测序及序列分析
摘要：茂原链霉菌（Streptomyces mobaraensis）是一种高GC含量的革兰氏阳性放线菌,它广泛用于生产转谷氨酰胺酶、博来霉素、莫能霉素等。目前,还没有相关研究报道茂原链霉菌的全基因组序列,这限制了基于功能基因挖掘和利用的定向育种以及分子遗传研究。本研究首次通过高通量测序技术对茂原链霉菌DSM40847进行全基因组测序,使用Velvet软件进行拼接得到266 contigs,整个基因组大小约7.5 Mb,GC含量为73.2%,序列已提交至美国国立生物技术信息中心（NCBI）的GenBank数据库。通过对基因组序列进行分析,成功鉴定转谷氨酰胺酶酶原激活相关蛋白基因,同时对该菌株的次级代谢产物合成基因簇进行了预测,相关研究结果将为茂原链霉菌的功能基因组学研究提供基础数据。重组大肠杆菌表达降氰酶的诱导条件优化
摘要：采用积分光密度法对产碱杆菌（Alcaligenes sp.）降氰酶基因在大肠杆菌中的高效表达进行了诱导条件优化,以工程菌BL21（DE3）-pET28a-cdE的诱导表达条件进行优化,以提高目的蛋白的产量和活性。结果显示,重组菌表达降氰酶的最佳诱导条件为温度28℃,初始菌体浓度OD600值为0.6,IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导时间12h。研究发现,诱导剂的添加浓度对外源蛋白的表达水平具有显著影响,使用终浓度为0.8mmol/L的IPTG,诱导表达12h,降氰酶蛋白收率达到143.27mg/L,比活力达到11560 U/mg。与不添加诱导剂相比,重组蛋白的收率和比活力分别提高了64倍和9倍。2份广西普通野生稻材料育性恢复基因Rf3、Rf4的恢复力评价
摘要：影响杂交水稻高产与稳产的重要因素是结实率的高低,而这一特性是由恢复系的恢复基因所决定的。因此,水稻恢复系的选育和利用具有重要意义。本研究以2份广西普通野生稻材料DP32和DP70为供体亲本,以籼稻品种9311为受体亲本,采用连续多代回交和分子标记辅助选择的方法,分别得到携Rf3、Rf4基因座位的5个单片段代换系。选用野败（WA）型细胞质不育系盟抗A和新质源（FA）型不育系金农1A对这5个单片段代换系的恢复能力进行测交鉴定。结果表明：（1）来自DP32的Rf3基因座位的单片段代换系能够恢复盟抗A,而来自DP70的Rf3基因座位的单片段代换系不能恢复盟抗A。（2）来自DP32或DP70的Rf4基因座位的单片段代换系都能恢复盟抗A。（3）来自DP32或DP70的Rf4基因座位的单片段代换系对盟抗A的恢复力均高于其Rf3基因座位的单片段代换系。（4）5个单片段代换系均不能恢复金农1A。本研究结果为在广西普通野生稻中挖掘和利用恢复基因种质提供参考,并且为进一步精细定位Rf3和Rf4基因创建了理想材料。SELEX技术筛选重组人超氧化物歧化酶核酸适体研究
摘要：运用指数富集配基系统技术（SELEX）筛选人超氧化物歧化酶（rhSOD）特异性核酸适体。体外化学合成长度为78 bp的中间含有35个随机序列的单链DNA文库,通过比较不对称PCR和生物素-链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA文库的效果,确定以生物素-链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA文库,采用硝酸纤维素膜为介质,以SOD蛋白为靶标,筛选其亲和性核酸适体,酶联仪测定定D450值,计算每轮ssDNA文库与靶分子的结合率。经过11轮筛选后,随机ssDNA文库与SOD的结合率从初始的0.47%上升到37.5%,随着筛选轮数的增加,ssDNA与靶分子结合率趋于稳定。初步筛选出具有高亲和力的SOD酶特异性核酸适体,为进一步开发和研究SOD新药及模拟药物提供参考。三种方法对细胞周期诱导效率的比较
摘要：比较两种处理方法对细胞周期调控的影响,本研究用饥饿法,胸腺嘧啶处理法和饥饿法结合胸腺嘧啶法诱导胎儿成纤维细胞进入G1/G0期。诱导两周后,收集3种方法来源的细胞用流式细胞技术、细胞活力检测、real-time PCR和核型分析检查细胞诱导效率、细胞活力、成纤维细胞特异基因的表达水平和核型情况。结果表明,实验组细胞G1/G0期比率显著高于对照组（p〈0.05）;实验组中,饥饿联合药物诱导法比饥饿法和药物法稍高,但未达显著水准。实验组与对照组细胞核型正常,均为40条染色体,性染色体为XX。细胞活力和显示,对照组比试验组稍高,但差异不显著（p〉0.05）;FGF4、FGF2及Sox2的基因表达水平在各组间差异不显著（p〉0.05）。这些结果表明,实验组3种方法对细胞特性没有显著影响,饥饿结合药物诱导可适当提高细胞诱导效率,为相关研究提供参考。鸭ChREBP基因多态性与血清生化指标关联性分析
摘要：鸭ChREBP（carbohydrate response element binding protein,碳水化合物反应元件结合蛋白）,是鸭糖酵解脂肪酸从头合成的重要调节因子之一,对调节机体糖脂代谢平衡有重要作用;本研究以PCR-SSCP结合直接测序对三穗鸭、兴义鸭、樱桃谷鸭3个鸭品种ChREBP基因外显子1、2、3、6、9、10、11、12、13进行多态性检测,分析SNPs位点与血清生化指标的关联性及对各指标的加、显性效应;结果显示,仅在樱桃谷鸭的外显子9中检测到了g.246911 G〉A突变,表明鸭ChREBP基因具有良好的保守性,产生了AA、AB、BB三种基因型,A和B两个等位因,B和BB分别为该位点的优势等位基因和优势基因型,其频率为0.575和0.450,多态信息含量（PIC）为0.369,属于中度多态,卡方（χ^2）检验发现,该g.246911G〉A突变位点的基因型分布在樱桃谷鸭群体中严重偏离了Hardy-Weinberg平衡,可能是因为长期人工选择的原因,关联性分析结果表明,AA基因型个体的血清生化指标除低密度脂蛋白没有达到显著水平外,其他指标均显著地高于BB基因型个体（p〈0.05）,加、显性效应显示,该位点对总蛋白、白蛋白、球蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总胆固醇具有显著的加性效应（p〈0.05）,对总蛋白和白蛋白有显著的负显性效应（p〈0.05）;推测g.246911G〉A为有利突变,AA和A分别为有利基因型和等位基因,可作为今后选育优秀生长性状樱桃谷鸭的遗传标记位点。贵州本地山羊STAT5A基因多态性及其与生长性状关联分析
摘要：本研究通过探讨STAT5A基因SNP与山羊生长性状关联性,旨在为山羊选种选育提供更好的科学依据。实验以贵州白山羊和贵州黑山羊为研究对象,采用DNA池法及PCR-SSCP技术检测STAT5A基因单核苷酸多态性。结果发现,在贵州白山羊和贵州黑山羊STAT5A基因内含子10均检测到1个SNP位点G127A,表现为3种基因型,分别命名为GG、GA和AA。基因型与生长性状关联分析显示,贵州黑山羊基因型GA个体的胸围和体重指标显著高于基因型GG个体（p〈0.05）,而其余3个指标均差异不显著（p〉0.05）;贵州白山羊基因型GA个体的体斜长、胸围和管围指标显著高于基因型GG个体（p〈0.05）,而其余指标均差异不显著（p〉0.05）。研究结果提示：STAT5A基因可能是影响山羊体重、体斜长、管围和胸围的主效基因或与主效基因连锁,G127A位点可望作为提高山羊个体生长性状的分子遗传标记。牛干扰素-τ在大肠杆菌中的融合表达和鉴定
摘要：牛干扰素-τ（bIFN-τ）是胚胎妊娠识别物质,通过体外重组表达bIFN-τ蛋白用于妊娠识别机理研究和胚胎工程应用具有重要意义。本研究的目的是利用大肠杆菌作进行bIFN-τ蛋白的体外重组表达和鉴定。通过PCR方法扩增得到牛干扰素-τ（bIFN-τ）基因,克隆到pMD18-T载体中。经BamHⅠ和NdeⅠ双酶切回收后连接到原核表达载体pET-28a（＋）中,构建了表达质粒（pET-28a-bIFN-τ）,然后将其转化大肠杆菌BL21（DE3）,并用IPTG进行诱导表达。结果表明：bIFN-τ基因序列插入方向和读码框在pET-28a-bIFN-τ中正确;表达产物分析表明其在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了融合表达,表达量占菌体总蛋白的20.68%。优化后的表达条件可使其表达量达到28.84%。重组蛋白主要以包涵体形式存在,经纯化和鉴定,表明表达产物为bIFN-τ蛋白。嗜水气单胞菌诱导的中华鳖SMART cDNA文库构建及相关基因的鉴定
摘要：以致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）人工感染的中华鳖（Trionyx sinensis）心、肝、脾、肾为材料,应用SMART技术（switching mechanism at 5＇end of RNA transcript）构建了嗜水气单胞菌感染组织的cDNA文库。将获得的cDN段连接到PGEM-T载体,然后电转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,PCR阳性检测结果显示插入片段在0.5～2 kb之间。该库含有4.3×10^5个重组子,重组效率为92%,本实验分析鉴定了164个≥1000bp的片段,39个序列在中华鳖中首次发现,鉴定的基因包括免疫基因11个;信号转导基因6个：催化类基因15个;转运相关基因3个;结构基因7个;未知基因9个。本实验文库的成功构建,不仅鉴定了中华鳖机体与细菌感染相关的免疫基因,同时为深入展开免疫学、系统发育和病原与机体的互作研究奠定了良好基础。尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中FoGAS1基因的克隆与序列分析
摘要：采用PCR和RT-PCR的方法,从尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中克隆得到了FoGAS1基因的DNA及cDNA序列,并运用生物信息学的方法对该基因所编码的氨基酸序列进行分析,预测其编码蛋白质的结构和功能。结果表明,FoGAS1基因全长1 672 bp,其中开放阅读框全长1 623 bp,编码含有540个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白分子量为58398.1,等电点pI=4.83,为性质稳定的亲水性蛋白。FoGAS1蛋白为跨膜蛋白,含有22个丝氨酸磷酸化位点,2个苏氨酸磷酸化位点,8个酪氨酸磷酸化位点。该蛋白在C端有一个信号肽结构,为一种分泌蛋白。通过系统进化树分析,该蛋白在不同种属镰刀菌中高度保守。十字花科黑腐病菌中一个与黄色素合成相关基因的鉴定
摘要：十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）能够产生大量的胞外多糖。胞外多糖商品名又称为黄原胶,具有广泛用途,在食品生产中可作为添加剂使用。为了得到不含黄色素的黄原胶,我们采用转座子EZ-Tn5随机插入诱变的方法对8004菌株进行突变,获得了一株不产黄色素的突变体。通过对突变体的转座子EZ-Tn5插入位点进行分析,发现该突变体是由于编号为XC_4097的基因被插入突变后衍生而来。同源性分析表明XC_4097编码一种脂质酰基转移酶,它与脂质的合成有关。采用同源双交换方法构建XC_4097基因的缺失突变体。通过对野生菌、突变体以及功能回补体的表型分析进一步证实了XC_4097基因功能的丧失只影响黑腐病菌黄色素的合成,而不影响细菌生长以及胞外多糖的合成。这为工业上生产无黄色素的黄原胶提供了应用基础。产β-甘露聚糖酶内生菌的诱变育种及产酶条件优化
摘要：以刺槐豆内生菌Paenibacillus sp.CH-3为出发菌株,采用紫外-硫酸二乙酯-亚硝酸盐对其进行复合诱变,并对菌株的发酵条件进行了优化。结果表明：经过紫外线-硫酸二乙酯-亚硝酸盐复合诱变,获得一株高产β-甘露聚糖酶的突变菌株Paenibacillus sp.CH3-05,其酶活力为160.2U/mL,较出发菌株（42U/mL）提高了281.4%。其最佳发酵培养基为：酵母膏0.25%,魔芋粉3%,磷酸氢二铵0.25%,氯化钠0.1%,硫酸镁0.3%,磷酸氢二钾0.2%,CaCl22 mmol/L。最佳发酵条件为：初始pH 6.5,接种量2%,培养温度35℃,转速200 r/min,培养时间78 h,在该条件下测得酶活为233.5 U/mL,较出发菌株提高456%。根癌农杆菌介导的绿色木霉HP35-3转化及表达体系的构建
摘要：本研究通过根癌农杆菌介导转化法,构建丝状真菌绿色木霉HP35-3的遗传转化表达体系,并以红色荧光蛋白基因（DsRed2）为报告基因来验证本表达体系。首先构建含有潮霉素抗性基因（HygR）、磷酸甘油醛脱氢酶启动子（Pgpd）和红色荧光蛋白基因（DsRed2）的双元载体pCAMT-CPRFP。然后将该双元载体转化到根癌农杆菌EHA105中,并筛选阳性转化子。将该转化子和绿色木霉HP35-3分生孢子进行液体共培养,并在含有150μg/mL潮霉素抗性平板上筛选出绿色木霉HP35-3RFP阳性转化子。最后分别通过如下三种方法检测：提取HP35-3RFP的总DNA进行PCR验证;对菌丝体进行荧光显微镜观察;对菌丝体提取物进行荧光酶标仪检测。结果表明：获得的转化子能够稳定遗传,外源红色荧光蛋白基因整合到木霉HP35-3的基因组中并成功表达。杜仲EuFLC1基因克隆与生物信息学分析
摘要：以杜仲（Eucommia ulmoides Olive）雄花花芽为材料,依靠实验室构建的杜仲转录组库,采用cDNA末端快速扩增法克隆了3＇端包含完整开放阅读框的745bpcDNA序列。经3＇RACE产物和转录组库中5＇端序列拼接,获得全长为872bp的杜仲FLC的cDNA序列,编码86个氨基酸,命名为EuFLC1。生物信息学分析显示：EuFLC1蛋白分子量约为10.005 kD,理论等电点为10.47,为亲水性蛋白;存在3个可能的磷酸化位点、1个可能的核定位信号和1个可能的核输出信号;不存在跨膜螺旋和信号肽;蛋白二级结构中包含2个α螺旋和4个β折叠,无规卷曲连接α螺旋及β折叠;蛋白三级结构同源建模结果表明,EuFLC1蛋白包含2个互相垂直的α螺旋,α螺旋间有2个处于同一平面的β折叠,蛋白的N端和C端为无规卷曲并伸向整体结构的一侧;是含有MEF2_like型MADS-box结构域的MADS-Box基因。Blastp结果中,与EuFLC1同源性较高的序列有：葡萄的floweringlocus C、小粒种咖啡的MADS-box protein FLC subfamily、巨峰葡萄的flowering locus C-like MADS-box protein,因此认为EuFLC1是杜仲FLC基因。系统发育树表明杜仲与同属唇形类植物的小粒咖啡聚为一支,与APGⅢ分类系统的分类结果一致。该基因为首次从第三纪孑遗植物杜仲中克隆到的MADS-Box基因,为研究MADS-Box基因的演化的提供了一个重要材料,为研究杜仲开花时间的分子调控机制奠定了基础。巴西橡胶树HbNAC33基因的克隆和表达分析
摘要：植物特有的NAC转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要功能。本研究从橡胶树胶乳cDNA中克隆了HbNAC33基因,生物信息学分析显示该基因的完整开放阅读框（ORF）为1 092 bp,编码363个氨基酸。HbNAC33蛋白的N-端第3～156位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,酵母试验表明,HbNAC33具有转录激活活性,转录激活区在C-端,具备了NAC转录因子的基本特征。序列比对和系统进化分析表明HbNAC33蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族。实时荧光定量PCR分析表明,HbNAC33在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶,乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）处理均能诱导HbNAC33的表达上调。以上结果表明,HbNAC33可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。毛白杨抗病相关转录因子基因PtWRKY1的表达特性分析
摘要：WRKY转录因子作为植物特有的一类重要转录调控因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应及形态发育和组织衰老等,已引起人们的关注。本文以前期克隆得到的毛白杨WRKY转录因子基因（命名为PtWRKY1）为研究对象,开展其基因枪介导洋葱表皮细胞瞬时表达、外源信号分子（水杨酸SA,茉莉酸MeJA,脱落酸ABA）诱导表达、转PtWRKY1基因烟草植株的烟草花叶病毒（TMV）接种实验以及抗病相关基因表达的实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析等研究。结果表明,PtWRKY1基因编码蛋白定位于细胞核,SA、ABA及MeJA处理均可诱导PtWRKY1基因表达,但不同诱导因子对PtWRKY1表达量的影响存在一定差异;同时,TMV侵染实验发现外源PtWRKY1表达能增强转基因烟草抗TMV能力,qRT-PCR分析表明PtWRKY1基因及膜保护性酶（POD,SOD,CAT）基因均受TMV诱导而增强表达。本文研究结果可为后续开展毛白杨转录因子PtWRKY1的功能鉴定及应用奠定基础。胡杨PeAPY1和PePY2在提高植物抗旱耐盐性上的功能解析
摘要：胡杨（Populus euphratica Oliv.）是典型的抗旱耐盐树种,广泛用于干旱盐碱地带的造林绿化。本实验室前期研究结果表明,盐胁迫下胡杨腺苷三磷酸双磷酸水解酶（Apyrase）基因（PeAPY）的转录水平上调,表明该基因可能在胡杨的抗盐性功能上发挥作用。已有研究证明APY是水解eATP的关键酶,而eATP是植物细胞重要的信使分子,调控植物的生长发育及抗性反应。本研究以PeAPY过表达拟南芥株系、拟南芥apy1、apy2突变体和野生型拟南芥为实验材料,分析了胡杨PeAPY对植物抗旱和耐盐能力的影响。研究结果表明,PeAPY1和PeAPY2转基因株系的抗旱性明显提高,这可能与PeAPY1和PeAPY2过表达减少了叶片表皮的气孔密度,降低了叶片的失水速率,从而提高了植株的保水能力有关。此外,我们还发现PeAPY1和PeAPY2转基因株系耐盐能力有所提高：在盐胁迫条件下,过表达PeAPY1和PeAPY2转基因植物的种子萌发率和生长、成活率均明显高于突变体apy1、apy2和野生型拟南芥（NaCl处理的浓度分别为0,50 mmol/L,100 mmol/L,150 mmol/L,200 mmol/L）。这可能是由于盐处理条件下,PeAPY通过降低盐诱导的eATP浓度,阻止了eATP诱导的细胞凋亡。综上所述,胡杨PeAPY的过表达能够提高植物对盐胁迫、干旱胁迫的耐受性,PeAPY对eATP浓度调控及其对植物抗逆性的具体机制有待进一步研究。
