基因组学与应用生物学杂志 北大期刊 CSCD期刊 统计源期刊

基因组学与应用生物学 2009年第03期杂志 文档列表

基因组学与应用生物学杂志研究报告

RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB417-421

摘要：RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB，为发光光状杆菌基因敲除提供方法。采用TOPO克隆方法将基因cipA和cipB克隆到质粒pTA上，获得质粒pTA-cipA和pTA-cipB；采用Red／ET方法分别将Gentd基因和Aprar基因分别插入pTA-cipA和pTA-cipB的cipa和cipB基因中，并替换cipA和cipB基因部分序列，获得pTA-Gentalncip A和pTA-ApralncipB；pTA-GentalncipA通过BamH I酶切，从0．7％琼脂糖胶上回收获得GentalncipA，将GemaIncipA导入带有质粒pASK-αβγA的P.luminescens subsp.Akhurstii中，通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipA；pTA—ApraIncipB用EcoR I酶切，从0．7％琼脂糖胶上回收获得ApraIncipB，将ApmIncipB导入带有质粒pASK-αβγA的P.luminescens subsp．Akhurstii中，通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipB；42℃下热激去除突变菌中的质粒pASK-αβγA。克隆PCR和SDS—PAGE电泳结果表明发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB均被敲除。采用RED同源重组法成功地敲除了发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB。

甜叶菊葡糖基转移酶基因UGT76G2的克隆及生物信息学分析422-428

摘要：本研究利用RT—PCR方法从甜叶菊（Stevia rebaudian）叶片中分离了与甜叶菊UGT76G1高度同源的UGT76G2基因，该基因编码一条分子量为52．029kD的由458个氨基酸残基组成的多肽，含有C-端所特有的高度保守的信号序列PSPG基序和N-端膜结合序列，属于植物中特有PSPG基序的UGT家族成员。半定量RT—PCR分析表明：UGT76G2在甜叶菊根、茎、叶、花不同组织中具有组织表达特异性，在叶组织中的表达丰度略高，在根中不表达而在茎中表达较低。推断的UGT76G2编码产物与其它参与植物次级代谢产物的糖基转移相关酶同源比对和系统发生分析表明该蛋白与康乃馨（Dianthus caryophyllus）DicGT4、棉花（Gossypium hirsutum）GhUGT1、甜叶菊（Stevia rebaudian）UGT76H1及玉米（Zea mays）BX8的一致性较高，分别为41％、35％、35％和32％。对UGT76G2和UGT76G1的次级结构和立体结构分析发现，苜蓿（Medicagosativ曲UGT71G1与二者的一致性皆为23％，它们有类似的次级结构。在C-端的PSPG信号区内具有10个相同的基质结合位点。但在UGT76G2和UGT76G1之间也有个别位置氨基酸存在差异。它们的N-端含有保守的组氨酸H25和天冬氨酸D124残基，可能与受体的结合有关。

乙醇脱氢酶（ADH）家族生物信息学分析429-432

摘要：本研究用生物信息学的方法分析了玉米等7个物种ADH的保守功能域、蛋白二级结构和进化关系。分析证实，植物ADH通常含有3个保守功能域，它们具有GroES结构的ADHN结构域，Rossmann折叠NAD（P）（＋）结合蛋白和锌结合位点，这3个保守结构在物种中具有相当的保守性。二级结构的分析表明，在我们研究的物种中，每个物种的两个ADH同工酶折叠情况大体相同，物种间蛋白二级结构也趋向一致。通过构建系统进化树，分析了供试物种中ADH以及ADH两个同工酶间的进化关系。初步显示，在进化上，单、双子叶植物源白不同的ADH祖先。双子叶植物ADH在物种间具有差异；而在单子叶植物不同物种其ADH同工酶出现分化。

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达433-438

摘要：本研究采用EST测序技术和RT—PCR技术，获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因——黄酮醇合成酶（FLS）基因，在GenBank登录（GenBank accession No．EF205150），其序列全长1317bp，其中开放阅读框长996bp，编码331个氨基酸，3]端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号，推测的蛋白分子量约为37．5kD，理论等电点为5．80。序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近。将该基因重组到表达载体pET-32a（＋）中进行原核表达，经IPTG诱导、SDS-PAGE检测，结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达，电泳检测到一条大约61kD的外源蛋白，与预测的融合蛋白分子量相符。用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化，得到了纯度在90%以上的纯化蛋白，为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础。

重组马槟榔甜蛋白MabinlinⅡ在大肠杆菌中的表达439-444

摘要：MabinlinⅡ是我国所特有且唯一的植物甜蛋白，在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物。本文根据己知马槟榔甜蛋白的序列设计引物克隆MabinlinⅡ基因，对基因进行剪切重组。将重组基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a（＋）中，构建了3个重组表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），得到三株表达重组马槟榔甜蛋白的大肠杆菌工程菌。经IPTG诱导，3个重组MabinlinⅡ基因可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达。

杨树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）基因启动子的克隆与分析445-449

摘要：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶，其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH，也为核酸合成提供戊糖；此外，还参加非生物逆境胁迫应答反应。因此，G6PDH对植物的生长发育起着非常重要的作用。本文利用甜杨G6PDH基因和毛果杨基因组序列，通过PCR获得了甜杨G6PDH基因上游1400bp的序列。序列分析结果表明，该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box。此外，还包含多个胁迫诱导元件，如低温诱导元件LTR，盐诱导元件GT-1，抗冻、缺水、脱落酸、抗寒元件MYB和MYC，以及光响应元件L-box、G-box、3AF-1、TC丰富区等。

TMV和PVY外壳蛋白双基因融合干涉及烟草转化450-454

摘要：为了降低烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）和马铃薯Y病毒（potato irus Y，PVY）复合侵染对烟草带来的危害，本实验找到TMV—CP和PVY—CP基因部分保守序列，将保守序列进行双基因融合，此双基因即为RNAi的靶序列，用限制性内切酶将双基因从pMD18-T载体上切下，正反向连接到pUCCRNAi载体后，经酶切鉴定后定向连接到含超强启动子的pC2300—35S—OCS表达载体上，利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中，构建含靶序列反向重复结构的RNAi双元载体系统，提取转化质粒，经酶切验证鉴定表明TMV和PVY外壳蛋白基因植物表达双元载体构建成功。并转化烟草，获得了3株对TMV和PVY抗性显著提高的转基因烟草。

碱性成纤维细胞生长因子在苜蓿中的表达455-459

摘要：为了降低bFGF（basic fibroblast growth factor）的生产成本，结合植物生物反应器的优点，就bFGF在转基因苜蓿中的表达进行了探索。将bFGF插入植物表达载体pBⅡ21中，获得了含有bFGF基因的植物表达pBIcbFGF，再将pBIcbFGF利用冻融法转到农杆菌中。利用农杆菌介导法将基因转化保定苜蓿，转基因苜蓿在TM-1培养基＋20mg／L卡那霉素（Kan）＋200mg／L特美汀（Tim）中诱导分化，在生根培养基中生根，获得再生植株。再生植株通过PCR检测、RT—PCR及Western blot证实外源基因已经在苜蓿中成功表达。获得含有目的蛋白的阳性植株。为苜蓿作为植物生物反应器生产bFGF奠定了理论及技术基础。

马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定460-464

摘要：RNA沉默（RNAi）介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。马铃薯Y病毒（PVY）在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害，并且造成严重的经济损失。本文以PVY的外壳蛋白（CP）基因为模板扩增300bp和354bp两个片段，正向和反向分别插入植物表达载体pROKⅡ的35S启动子下游，从而构建了以PVY的CP基因为靶标的RNAi植物表达载体pROKY300，转入农杆菌EHA105中，以农杆菌渗入法在本氏烟中瞬时表达与wyCP同源的hairpin RNA。结果表明，瞬时表达的hairpin RNA有效干涉了PVY侵染。

花粉管通道法介导的真菌耐盐基因转化拟南芥465-470

摘要：橡胶树内生真菌ITBB2-1具有很强的抗盐性，在培养基中添加2倍海水盐度的NaCl能显著促进菌落的生长。采用两种方法研究利用花粉管通道法将ITBB2-1耐盐基因导入拟南芥。多数耐盐转基因植株畸形，生长发育不正常。通过对一千两百余株转基因植株的筛选，获得了耐盐性显著提高、生长发育正常的转基因植株3个。对主要农艺性状统计分析发现，转基因植株叶片的长度、宽度和面积均比野生型植株小，差异达极显著水平。转基因植株SR3的角果长度仅为野生型的64．5％，SR1和SR2的角果长度与野生型无显著差异。本研究表明，在真菌耐盐机制尚未得到研究和耐盐基因尚未克隆的情况下，可以采用花粉管通道法将其耐盐特性导入高等植物中。

苏云金芽孢杆菌S1478—1分离株的特性鉴定及cry1Ac同源基因克隆471-476

摘要：本研究对从海南岛尖峰岭热带雨林自然保护区的土壤样品中分离出的＆菌株S1478～1进行了特性鉴定，研究表明S1478—1分离株菌落形态和生长特征和励参照菌株HD73极其相似。16SrDNA序列分析表明，S1478—1分离株与其它＆thuringiensis、B．cereus和B.anthracis的16S rDNA序列相似性达到99％。分离株能产菱形伴胞晶体，SDS-PAGE蛋白电泳分析表明，菌株在生长后期，形成芽孢同时分泌130kD大小的晶体蛋白。生物测定表明S1478—1分离株对小菜蛾具有很高的毒杀活性，LC50值高达5．159×10^8cfu／mL。初步显示S1478—1分离株可作为防治鳞翅目害虫的生物农药菌株。利用PCR—RFLP方法鉴定S1478—1分离株含有cry1Ac同源基因，以PCR粘性端克隆方法扩增全长基因，序列测定表明该基因ORF为3537bp，编码1178个氨基酸，推定的编码蛋白分子量为133．3kD，与其它cry1Ac基因序列最高达到99％同源，因此，该基因可作为杀虫工程菌及培育转基因抗虫作物的候选基因。

稻草秸秆纤维素分解菌的分离筛选477-480

摘要：本研究基于获得高效木质纤维素分解菌的目的，以刚果红纤维素琼脂和滤纸条培养基为初筛培养基，从分离获得的124株真菌中筛选出透明圈与菌落直径比值较大、滤纸条分解能力较强的11个菌株。经液体发酵，测定其酶活力，复筛得到羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活均较高的4个菌株；并进行了不同碳源和不同pH对筛选菌株产酶能力的影响试验，发现不同菌株对不同纤维素物质的分解能力不一样，同一菌株对不同纤维素碳源的利用能力也不相同。

五氯酚厌氧生物降解体系中细菌的多样性分析481-485

摘要：为了解五氯酚（PCP）降解过程中参与PCP降解的微生物多样性，本文应用16SrRNA基因克隆文库方法对PCP厌氧生物降解体系中细菌群落的组成和相对丰度进行了研究。结果表明，TM7类群的微生物在整个细菌群落中占有最大丰度（48．6％），检测到的序列与在三氯乙烯污染的地下水中检测的克隆子有一定的序列相似性（93．6％）。丰度位居第二的微生物类群为β-变形菌纲（Betaproteobacteria）细菌，其中的一些克隆子（10．8％）与脱氯微生物Dechlorosoma suillum具有极高的序列同缘性（99．7％）。此外，也检测到少数Clostridium属[厚壁菌门（Firmicutes）类群]的微生物。克隆文库中发现许多序列（占整个克隆文库的51．3％）与GenBank中已报道的序列具有较远的同源性（小于93．4％），它们可能代表新的微生物。本研究进一步拓宽了对PCP降解微生物多样性的认识。

来自海南等地的17个Bt分离株质粒多样性分析486-492

摘要：本研究采用琼脂糖凝胶电泳对分离白海南岛的12个反菌株与分离自广西、黑龙江的5株＆菌株及2株胁模式菌株进行质粒数量、大小等特征分析。19个供试菌株可区分为16种独特的质粒电泳图谱，充分显示出不同来源肪菌株的质粒多样性。进一步选择了其中的10个菌株，利用包埋法制备琼脂块进行脉冲场凝胶电泳（PFGE），结果表明苏云金芽孢杆菌大质粒组成特征也具有丰富多样性。但是供试菌株的质粒电泳图谱并未体现与地理和生态特征相关联的特征差异。研究结果初步证实海南分离株S3078—1是一株无内生质粒的助菌株，而S3031-1和S3073—1两个分离株仅有一个大质粒存在，这三个分离株将为进一步研究质粒功能提供初始菌株。本研究进一步暗示将琼脂糖凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳结合起来研究质粒特征提高了结果的可靠性。

3种玻璃化冷冻液对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后体外发育的影响493-497

摘要：本试验主要探索了3种玻璃化冷冻液对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后体外发育的影响。水牛MⅡ期卵母细胞经3组玻璃化冷冻液（Ⅰ：20％乙二醇（EG）＋20％二甲基亚砜（DMSO）；Ⅱ：20％EG＋20％丙二醇（PROH）；Ⅲ：20％EG＋20％PROH＋10％DMSO）毒性试验后，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组体外受精的分裂率、8-细胞率和囊胚率之间差异不显著（P〉0．05），分裂率均显著低于对照组（P〈0．05），但Ⅱ组8-细胞以后的发育潜力跟对照组无显著差异（P〉0．05）。进一步比较了3组玻璃化冷冻液对卵母细胞的玻璃化冷冻效果。卵子解冻后进行体外受精后，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组的发育潜力均显著低于对照组fP〈0．05），各组的8一细胞率和囊胚率之间无显著差异（P〉0．05），但Ⅱ组卵裂率明显高于Ⅰ组（24．8±4．6％VS12．7±1．5％，P〈0．05）。结果表明，3种冷冻玻璃化保护液均可用于冷冻水牛MⅡ期卵母细胞，其中Ⅱ组处理的卵母细胞体外受精效果相对较好。

全基因组测序方法用于突变研究497-497

摘要：美国斯托瓦斯医学研究所研发了一种“全基因组测序法”定位果蝇突变基因的方法。这项新的技术方法能大幅度减少寻找果蝇的突变基因所花费的时间和精力。

47份水稻品种资源的ISSR遗传多样性分析498-502

摘要：为研究广东省惠州市种植的常规水稻品种的遗传多样性，本实验利用ISSR标记对47份水稻品种资源进行遗传多样性检测。从49条引物中筛选出5条重复性好，条带清晰的引物进行PCR扩增，共扩增出53条带，每个引物可以扩增出9～13条带，平均为10．6条，其中47条具有多态性，比率为88．7％。不同水稻品种间遗传相似系数变幅为0．319～0．936，平均达0．691，说明ISSR标记能够揭示材料间较高的遗传多样性。通过聚类，从分子水平对水稻品种资源的遗传关系进行分析，并对47份水稻品种资源进行分类，ISSR标记能将47份水稻品种完全区分开，为水稻品种资源的研究利用提供参考。

我国甘蔗亲本遗传多样性的AFLP标记分析503-508

摘要：采用15对多态性较好的AFLP引物对我国自育的78个甘蔗亲本材料遗传多样性进行分析，结果表明，每对引物的多态性位点平均为65．67，多态陆位点率为82．55％。78个甘蔗亲本的遗传相似系数在0．4535～0．8927之间，平均为0．6821。相同组合后代的遗传相似系数较高，平均为0．7656。以遗传相似系数阈值约为0．700划分，聚类分析把78个亲本分为7大类，系谱记录中亲缘关系密切的亲本品系，大多数都能归为同一类。遗传多样性指数分析显示，不同年代亲本多样性指数差异明显，20世纪80年代最高，为0-3185，70年代最低，为0．2645；不同省区的亲本遗传多样指数变化更显著，在0．1952～0．2999之间，广东最高，云南最低。